摘要
目的： 甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常见的分化型甲状腺癌，且发病率呈现逐年上升趋势。盐酸石蒜碱（lycorine hydrochloride，LH）是一种具有多种药效的中药单体。但盐酸石蒜碱是否能抑制甲状腺乳头状癌以及其相关机制并不清楚。本研究通过体内和体外模型探讨盐酸石蒜碱抑制甲状腺乳头状癌的作用及其机制。 方法： 1.通过CCK-8检测LH处理甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1和K148h后IC50。根据IC50确定后续研究LH的浓度，CCK-8、平板克隆和EdU检测LH对TPC-1和K1细胞的增殖影响，FCM和荧光显微镜观察LH对TPC-1和K1细胞的ROS影响，FCM和透射电子显微镜观察LH对TPC-1和K1细胞的线粒体膜电位以及线粒体超微结构的影响，FCM和Western Blot检测LH对TPC-1和K1细胞细胞凋亡的影响及凋亡相关蛋白的表达。 2.Western Blot和免疫荧光检测LH处理TPC-1和K1细胞后MAPK通路蛋白的表达及MAPK磷酸化蛋白的细胞分布情况。用ROS抑制剂NAC处理后，FCM和免疫荧光观察抑制ROS的效果，FCM观察NAC与LH共处理后对细胞凋亡和线粒体膜电位的影响，CCK-8和EdU监测NAC与LH共处理后对细胞的增殖影响，Western Blot检测NAC与LH共处理后对MAPK通路的影响。 3.裸鼠皮下注射K1细胞构建PTC体内模型，通过瘤体积变化、瘤重、肿瘤组织HE染色、以及免疫组化检测Ki-67和PCNA的表达来观察LH治疗裸鼠体内PTC的疗效。通过比较对照组和LH用药组的肝脏、肾脏、心脏组织的HE染色，以及生化检测法检测血清中AST、ALT、CRE、BUN、UA的变化来检测LH的体内应用安全性。 结果： 1.CCK-8结果显示，LH处理48h TPC-1细胞的IC50是在2.152μmol/L和2.486μmol/L之间，K1细胞的IC50是在1.700μmol/L和2.521μmol/L之间。CCK-8、平板克隆和EdU的结果显示LH对甲状腺乳头状癌细胞呈现剂量依赖性抑制；FCM和荧光显微镜观察到细胞内ROS呈剂量依赖性升高；FCM结果显示LH处理48h后，细胞凋亡率和线粒体膜电位去极化呈剂量依赖性升高；透射电子显微镜观察到LH处理后细胞线粒体超微结构受损；细胞凋亡相关蛋白也与LH的剂量呈现一定的相关性。 2.Western Blot的实验结果表明，MAPK通路蛋白的激活程度和LH的处理剂量几乎呈正比，且用免疫荧光观测记录到了LH处理后部分磷酸化的MAPK蛋白的入核现象。NAC抑制细胞ROS后，NAC和LH共处理组后，CCK-8和EdU检测观察到细胞增殖抑制得到改善；FCM检测观察到细胞的凋亡率、线粒体膜电位的下降率的显著好转；同时，Western Blot结果显示，NAC共处理后MAPK通路蛋白的激活得到部分抑制。 3.裸鼠对照组和LH用药组的体重没有统计学意义，但用药组的裸鼠瘤重以及瘤体积相对于对照组下降，且具有统计学意义；瘤组织的HE切片结果显示，LH组的瘤细胞出现坏死、细胞破碎以及核碎裂等现象。肝脏、肾脏和心脏的HE结果显示，两组组织结构均正常；血清中生化指标除了LH组的UA下降外，其余指标AST、ALT、CRE、BUN则变化无统计学差异；此外，免疫组化结果显示Ki-67和PCNA在LH组的染色强度降低。 结论： LH能抑制甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1和K1的增殖，并促进细胞内ROS产生、细胞凋亡、线粒体膜电位去极化，以及线粒体超微结构受损。LH可促进TPC-1和K1细胞MAPK通路的激活、MAPK通路磷酸化蛋白的入核，而使用ROS抑制剂NAC后，可以部分逆转LH对甲状腺乳头状癌细胞的生物学功能的影响。同时，裸鼠体内成瘤实验也对LH的抑癌作用得到验证，显示LH动物体内应用的抑癌疗效和生物安全性。
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