摘要
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，Cp）是一种重要的人畜共患革兰氏阳性厌氧菌，能够产孢子，在污水、土壤以及人和动物的消化道中广泛存在，可以在环境中水平传播。Cp可分泌多种毒素，目前已报道有20种以上，根据其分泌的主要致病性毒素（α、β、ε、ι）不同可将Cp分成A、B、C、D、E共5型，可引起人食物中毒，动物坏死性肠炎、痢疾、猝死症等。世界各国Cp爆发引起的食物中毒事件层出不穷，食品烹饪过程中温度控制不佳及肉类制品的储存不当是爆发肠胃炎的主要原因，严重威胁人类健康。生禽肉中Cp的污染主要来源于禽肉屠宰加工中肠道Cp，然而目前的化学杀菌剂对于Cp控制不佳且易产生残留，因此亟须有效的Cp生物防控方法，减少Cp的污染，保障人类健康。 （1）采集来源于不同养殖场的动物组织及粪样，鉴定出52株Cp，其中鸡源Cp29株，牛源Cp15株，羊源Cp8株，将不同来源Cp根据毒素进行分型比对和耐药性鉴定。结果表明，52株分离株均为A型Cp，耐药分析表明不同来源的Cp对10种抗生素均呈现不同程度耐药特性。鸡源Cp对四环素（12/29，41.38%）耐药率最高，而羊源和牛源Cp对克林霉素表现出高耐药率分别为62.50%（5/8）、73.33%（11/15）。在不同来源分离株中，牛源的多重耐药率最高，其次是鸡源、羊源，分离株主要对2种和3种抗生素表现出多重耐药性。耐药基因分析表明主要耐药基因为四环素类，tetA检出率高达94.23%；其次是tetB、tetM检出率分别为65.38%、17.31%。此研究明确了不同来源（鸡、羊、牛）Cp毒力型，其耐药严重且普遍携带四环素类耐药基因，从而加剧了耐药传播风险，此结果为Cp引发的食源性疾病防控提供参考依据。 （2）噬菌体因其特有的杀菌效力已受到食品及医药行业的高度关注，针对耐药性Cp获得其特异性噬菌体能够为Cp的有效防控提供抑菌资源。根据分离获得的Cp流行株与参考菌株ATCC13124从鸡源粪样中分离其特异性噬菌体，并对其作用宿主、裂解效力及生物学特性进行分析。结果表明，分离获得裂解性Cp噬菌体vB_CpeP_HN02为短尾噬菌体（简称HN02）。噬菌体HN02具有良好的pH值（5~11）和温度耐受性（lt;70℃），其宿主范围为23.08%，吸附细菌迅速，爆发期长，平均爆发量达到27.67PFU/cell。噬菌体HN02基因组为线性双链DNA，全长17,754bp（GenBank MW815121），GC含量为28.2%。基因组包含22个开放阅读框（ORF），其中仅有10个ORF与已知序列具有一定同源性。根据噬菌体主要衣壳蛋白构建系统发育树，结果表明噬菌体HN02与裂解性Cp噬菌体phi24R和CPD2高度同源。综上所述，噬菌体HN02为Podoviridae家族成员，对Cp具有良好的裂解活性，为噬菌体在Cp防控中的应用奠定基础。 （3）噬菌体HN02能够有效抑制Cp的生长，能够为生鸡屠宰加工中Cp的防控提供技术资源。通过雏鸡模型分析Cp噬菌体HN02在体内的安全性。通过发酵来制备高效价噬菌体HN02并将其应用于鸡肉中分析其潜在的抑菌效力。结果表明，噬菌体HN02对雏鸡日常行为无显著影响，雏鸡无死亡，器官组织无异常。建立并优化了Cp噬菌体厌氧发酵技术，在37℃下，通过12h的发酵并添加20mmol/mL Ca2+可获得高效价的Cp噬菌体(gt;109PFU/mL)。噬菌体HN02在生鲜鸡肉表面能够有效抑制Cp的生长，高浓度HN02（1010PFU/mL）能够在48h完全抑制Cp的生长。由此可见，噬菌体HN02不仅安全，且能够用于屠宰加工中的抑菌保鲜，为食品中Cp污染防控提供了新策略。
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