摘要
马尾松（Pinus massoniana Lamb．）是中国南方最广泛的针叶树之一，占南方各省森林蓄积量一半以上，其适应性强、生长快、分布广，是重要用材林树种。植物蔗糖代谢不仅参与生长发育，还响应多种非生物逆境胁迫，探讨蔗糖代谢对逆境胁迫的应答机制，对提高植物抗逆性具有重要意义，但迄今少见马尾松蔗糖代谢相关基因的报道。本文鉴定到12个蔗糖代谢相关基因，并对基因的表达进行分析验证；从中筛选出两个蔗糖合酶基因PmSUS1和PmSUS2，分析其不同非生物胁迫下的表达情况，并遗传转化烟草和拟南芥验证功能，主要研究结果如下： 1.马尾松蔗糖代谢相关基因的鉴定 通过对马尾松高、低脂种质转录组测序结果的分析，鉴定出SUS、INV、SPS三类共12个蔗糖代谢相关基因，通过表达分析验证其表达量与转录组基本一致。 2.马尾松蔗糖合酶基因的克隆 以转录组序列为模板设计引物，克隆了两个马尾松蔗糖合酶基因的ORF全长，命名为PmSUS1和PmSUS2，ORF序列分别为2,454bp和2,460bp，分别编码817和819个氨基酸，编码产物都含有典型的蔗糖合酶（sucrose synthase，PLN00142）保守结构域；分别预测分子量93.21kD和93.79kD，理论等电点pI分别为6.02和6.04；系统进化分析表明，PmSUS1和PmSUS2与火炬松SUS蛋白同源性最高，亲缘关系最近。 3.PmSUS1和PmSUS2对非生物胁迫的应答 利用qPCR技术分析PmSUS1、PmSUS2基因在不同非生物胁迫下的表达。在低温、干旱胁迫下两基因都上调表达，在低温胁迫过程中从0h~48h表达量都呈上升趋势，48h时最高。干旱胁迫中，重度干旱的表达量是对照1．29~1．56倍。在茉莉酸甲酯和机械损伤胁迫下PmSUS1、PmSUS2表达模式不同，茉莉酸甲酯处理下PmSUS1表达水平先上升后下降，PmSUS2为上升下降再上升。 4.PmSUS1和PmSUS2基因的遗传转化 分别构建了PmSUS1、PmSUS2基因超表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法和花序浸染法将两基因转化烟草和拟南芥。经过筛选与分子检测，成功鉴定到PmSUS1、PmSUS2转基因烟草株系各8株，PmSUS1、PmSUS2转基因拟南芥株系各4株。转基因烟草qPCR检测结果表明：PmSUS1在8个转基因烟草株系中6号株系表达量最高，2号株系最低；PmSUS2在其8个转基因烟草株系中，2号株系表达量最高，7号株系最低。 5.转PmSUS1和PmSUS2基因对烟草含糖量的影响 通过对PmSUS1、PmSUS2转基因烟草表达量各自最高的3个株系及野生型进行糖含量测定，得到PmSUS1转基因烟草的蔗糖和可溶性糖含量都小于野生型烟草，而PmSUS2转基因烟草蔗糖和可溶性糖含量都大于野生型。 6.转PmSUS1和PmSUS2基因提高拟南芥抗逆性 对拟南芥PmSUS2转基因株系进行抗逆性研究，得到低温和干旱胁迫下转基因抗氧化酶活性、蔗糖含量、可溶性糖含量均上升，丙二醛（MDA）含量较野生型低，综合推测PmSUS2基因的过表达提高了拟南芥抗逆性。本研究结果为深入研究蔗糖合酶在马尾松中的功能奠定了基础。
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