摘要
在单萜吲哚类生物碱的合成途径中，异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase,STR)催化色胺和裂环马钱子苷生成异胡豆苷。本研究基于钩藤（Urcaria rhynchophylla（Miq.）Miq.ex Havil.）转录组Blast分析，得到全部的STR成员，通过生物信息学分析得到候选基因，通过对候选基因进行克隆、表达分析、亚细胞定位、原核表达、启动子的克隆及活性验证等几方面的实验内容,得到以下研究结果： 1）钩藤中MIA合成途径中STR基因的挖掘 通过转录组分析在转录组中鉴定到25条STR家族成员，将筛选得到的STR家族成员与报道过的其它植物中STR进行系统进化树构建，钩藤UrSTR基因被分为3个亚家族。综合分析其motifs、保守结构域、系统进化树以及基因的表达情况等，选择UR_transcript_32860作为钩藤中候选STR基因进行克隆。 2）候选基因及启动子的克隆 提取转录组中UR_transcript_32860，分析并设计STR基因核心序列特异性引物，通过染色体步移技术扩增UrSTR基因及上游启动子，结果表明：UrSTR基因ORF框全长1038bp，编码345个氨基酸，属于不稳定蛋白；UrSTR基因上游有5''UTR区287bp，克隆到启动子长1179bp。 3）候选基因编码蛋白的功能定位及原核表达分析 构建UrSTR基因编码蛋白的亚细胞定位表达载体，共定位实验结果表明，UrSTR蛋白定位表达于液泡膜，进一步证明UrSTR基因属于植物中STR基因家族；生物信息学分析表明UrSTR基因编码蛋白具有信号肽，设计引物去除信号肽构建原核表达载体，成功在Rosseta(DE3)感受态细胞中表达出重组蛋白。 4）候选基因启动子的活性验证 克隆得到的UrSTR基因启动子顺式作用元件分析表明，启动子区具有脱落酸、光照和茉莉酸甲酯等顺式作用元件，没有乙烯顺式作用元件。构建PI121-STRpro::GUS表达载体验证UrSTR基因启动子活性。 5）候选基因的表达分析 实时荧光定量PCR检测钩藤中不同组织、发育表达情况，外源激素脱落酸、乙烯处理和光照处理下的UrSTR基因表达情况，结果表明：UrSTR基因是组织表达性基因，在钩藤各组织中均有表达；UrSTR基因随着叶片的成熟，表达量逐渐降低；UrSTR基因会受到脱落酸、光照等诱导表达，乙烯处理下表达不显著。
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