摘要
马铃薯晚疫病是对马铃薯危害最为严重的病害之一，会导致马铃薯大面积减产甚至绝收。嫁接技术已广泛应用于提高农作物抗逆性，然而，嫁接对提高马铃薯晚疫病抗性的分子机制尚不清楚。本研究将高抗晚疫病的马铃薯品种青薯9号（简写Q）与易感晚疫病的马铃薯品种费乌瑞它（简写F）进行嫁接，探究嫁接对接穗晚疫病抗性的影响，以及接穗相关生理生化和基因表达变化的原因，以期解析嫁接对马铃薯晚疫病抗性影响的机理。研究取得如下结果： 1.本研究使用“劈接法”对马铃薯抗病品种Q和感病品种F进行嫁接，获得不同嫁接组合的植株，分别为F、Q的自根嫁接植株和F和Q互为砧穗的嫁接植株，待嫁接植株长势稳定后，取接穗叶片进行晚疫病抗性鉴定，结果表明，接种致病疫霉菌（P.infestans）后，自根嫁接植株F/F和嫁接植株F/Q接穗F叶片病斑占比均低于未嫁接植株F，差异达到显著水平（Plt;0.05）；而Q自根嫁接植株Q/Q以及嫁接植株Q/F的接穗Q的叶片病斑占比相比未嫁接的植株Q均无显著变化。说明易感病品种F自根嫁接以及与抗病砧木嫁接晚疫病抗性均有提高，而抗病品种Q自根嫁接以及与感病砧木嫁接晚疫病抗性无显著变化。 2.在接种P.infestans后第0、5、10、15天取自根嫁接植株F/F和嫁接植株F/Q的接穗F叶片进行过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性以及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量测定。结果表明，受到病原菌侵染后，POD和SOD的活性均呈先上升再下降的趋势，且嫁接植株F/F和F/Q的接穗POD和SOD活性高于未嫁接植株F，差异达到显著水平（Plt;0.05），MDA的含量呈现上升趋势，嫁接植株F/F和F/Q接穗的MDA含量低于未嫁接植株F，差异达到显著水平（Plt;0.05）。以上结果说明，嫁接提高了易感病马铃薯接穗的POD、SOD的活性，从而提高其抗氧化能力，降低膜脂过氧化程度，而提高易感病植株的抗病性。 3.利用RNASeq平台对抗病品种Q和感病品种F以及其互为砧木与接穗嫁接植株的接穗部位进行二代转录组测序。对差异表达基因（Different expression genes,DEGs）进行富集分析，GO（Gene oncology）富集结果表明，两组DEGs大部分均与伤口反应、细胞部分、对刺激的反应、生物调控和催化活性有关，说明了大量与细胞重排、细胞分裂、代谢模式相关及应激反应相关的基因在嫁接后接穗中的转录发生了变化。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集结果表明，嫁接植株F/Q的接穗F相比未嫁接的F有3152个基因表达量上调，4389个基因表达量下调，表达量上调的基因主要富集于参与植株抗性反应的植物病原体相互作用、植物MAPK信号通路以及植物激素信号转导3条参与植株抗逆反应的通路中；表达下调基因主要富集于核糖体、光合作用等通路中；嫁接植株Q/F的接穗Q相比未嫁接的Q有151个基因表达量上调，329个基因表达量下调，表达上调基因主要富集于内质网中蛋白加工通路中；表达下调基因富集于精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸链伸长等通路中。 4.在嫁接植株F/Q的接穗F中表达量上调的基因中发现有72个与晚疫病抗性相关基因，主要为植物病原体相互作用、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解以及β-丙氨酸代谢途径上的基因，这些基因不仅可参与提高嫁接马铃薯接穗F的晚疫病抗性，亦可帮助嫁接伤口的愈合。从中筛选了7个编码晚疫病响应蛋白的基因，病程相关蛋白（StPR1）、几丁质触发子受体激酶（StCERK1）、钙依赖性蛋白激酶（StCDPK10）、油菜素类固醇不敏感相关受体激酶（StBAK1）、脱落酸受体PYL4（StPYL4）、病程相关基因非表达子NPR3（StNPR3）、LRR型丝氨酸/苏氨酸类受体蛋白激酶（StLRR-RLK），对其进行表达量以及启动子分析。表达量分析结果表明7个基因在嫁接植株F/Q的接穗F中的表达量均比自根嫁接植株F/F和未嫁接植株F高，其中6个基因StBAK1、StCDPK10、StPR1、StLRR-RLK、StNPR3和StPYL4的表达量在自根嫁接植株F/F中表达量亦有所提高。启动子分析结果表明，7个基因的启动子区域均含有激素响应以及逆境响应元件，其中3个基因含有受伤诱导响应元件。以上结果说明，嫁接后，感病接穗F的晚疫病抗性提高，与抗性基因表达量提高有关，而抗性基因是受到了抗病砧木、嫁接创伤应激以及接穗部位激素积累的影响导致表达量提高。 5.未嫁接的植株Q和F的晚疫病抗性鉴定结果表明，Q的晚疫病抗性极显著高于F（Plt;0.01）。对其转录组数据进行分析，发现Q相比F有1410个基因表达量上调，1429个基因表达量下调，表达量上调的基因中有70个抗病相关基因。对嫁接植株接穗的转录组数据中表达量上调的基因进行分析，发现有3个编码参与植物抗逆反应的G型凝集素S受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶LecRLK蛋白的基因不仅在未嫁接的Q中表达量较高，且在嫁接植株F/Q的接穗F中表达量亦高于未嫁接的F，将其命名为StLecRLK1、StLecRLK2和StLecRLK3。对其进行表达量和启动子分析，结果表明3个基因在嫁接植株F/Q的接穗F中表达量均有所提高，StLecRLK1基因在自根嫁接植株F/F接穗中表达量亦有所提高，此外，3个基因的启动子区域均含有植物激素响应元件，其中StLecRLK2的启动子区域含有创伤响应元件。以上结果说明，与抗病砧木Q嫁接后，感病接穗F的晚疫病抗性提高，与StLecRLK1、StLecRLK2和StLecRLK3基因表达量提高有关，其表达量提高是受到了抗病砧木、嫁接创伤应激以及接穗部位激素积累的影响。 6.成功克隆了StLecRLK1和StLecRLK2基因，对其进行生物信息学分析，表明2个基因均为马铃薯G型凝集素蛋白激酶基因（G-Type LecRLKs），2个蛋白均位于质膜上且具有信号肽和跨膜结构。对其启动子区域进行分析并验证，结果表明，StLecRLK1和StLecRLK2基因分别受生长素和创伤刺激诱导所致表达量提高。在马铃薯和番茄中瞬时超表达以及在“小汤姆”番茄中稳定超量表达的结果表明，超量表达StLecRLK1和StLecRLK2基因的植株晚疫病抗性均有所提高，说明StLecRLK1和StLecRLK2基因增强了植株的晚疫病抗性。结果说明，嫁接后，感病接穗中生长素积累、创伤刺激以及抗病砧木均诱导StLecRLK1和StLecRLK2基因表达量提高，从而增强感病接穗的晚疫病抗性。
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