引起李细菌性穿孔病的Pantoea agglomerans快速检测技术及药剂活性评价

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中文摘要：细菌性穿孔病是李生产上重要的细菌性病害，在我国李主产区普遍发生，目前还没有登记用于李树上防治该病的药剂。为有效防控该病害，本论文调查了贵州李主产区不同品种细菌性穿孔病发生情况，并采集样品分离鉴定了该病病原，同时针对致病菌建立了环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP），开展了杀菌剂对其毒力测定及四霉素抑菌机理初探，并将建立的LAMP技术应用于由成团泛菌（Pantoea agglomerans）引起李细菌性穿孔病的田间防治，以期为李细菌性穿孔病早期诊断及精准防控提供参考。主要研究结果如下：（1）掌握了贵州李主产区细菌性穿孔病发病情况，明确其致病菌为Pantoea agglomerans。2020～2021年在贵州李主产区调查发现，李细菌性穿孔病在修文县、遵义市平正乡及松桃县等园区脆红李和酥李品种上发生较为严重，于每年4月中下旬或5月初开始发生。对采集的545个病叶和病枝条样品进行分离、纯化、回接后得到HXFJ、HSFJ、HSFJ-1、KY、KYY、LY和XWFJ7株代表菌株。通过形态学观察、生理生化特征，并结合分子生物学分析，明确了引起李细菌性穿孔病致病菌为P.agglomerans。该病原菌培养20h后进入生长缓慢期，36h后进入衰亡期。温度为30℃、pH为7时利于该病原菌生长。（2）基于LAMP技术建立了P.agglomerans快速检测体系。以成团泛菌gyrB基因序列设计了3对引物，并对LAMP初始反应体系和条件进行了优化，在65℃下反应60min扩增效果最佳。通过特异性检测证实了LAMP引物组仅对P.agglomerans呈现阳性，灵敏度验证LAMP体系最低检测限为5fg/μL，比常规PCR高1000倍。建立的LAMP检测体系可从室内接种样品及田间样品中快速准确地检测到P.agglomerans。（3）明确了不同杀菌剂对P.agglomerans的毒力，并初步探索了四霉素对P.agglomerans的作用机理。10种杀菌剂中0.3%四霉素水剂（AS）对P.agglomerans毒力最强，EC50为1.7056μg/mL；其次为2%春雷·四霉素可溶性液剂（SL），EC50为75.5011μg/mL。设置EC50和EC75两种浓度处理，初步开展了四霉素作用机理初探。该药剂对P.agglomerans保护作用强于治疗作用。四霉素作用菌体后，EC75处理P.agglomerans培养液的电导率随作用时间延长，电解质外泄越严重，且P.agglomerans胞内DNA和蛋白质等大分子物质也发生外泄，说明P.agglomerans细胞膜通透性发生改变；同时四霉素EC50和EC75处理对P.agglomerans生物膜形成及胞外多糖的产生也具有明显抑制作用，其中EC75处理对生物膜形成的抑制率达51.26%。四霉素处理后，P.agglomerans菌体丙酮酸含量升高，苹果酸脱氢酶活性降低，ATP含量下降。可见，四霉素可抑制生物膜形成，破坏细胞膜稳定性，引起能量代谢紊乱，从而抑制P.agglomerans生长。（4）结合LAMP检测提前防控，应用0.3%四霉素AS可有效防控李细菌性穿孔病。在检测出阳性时开展田间防控，与未检测防控组（出现病害症状后开始防控）相比，相对防效明显提高。其中0.3%四霉素AS施药2次后7d LAMP检测防控组的病情指数比未检测防控组低36.36%。说明应用LAMP检测开展细菌性穿孔病早期诊断是可行的，有利于精准防控。同时0.3%四霉素AS处理对细菌性穿孔病的防效最好，在LAMP检测防控组中施药2次后7d、14d的防效分别达78.23%和72.5%。0.3%四霉素AS处理还可提高李果单果重、维生素C和可溶性糖含量。

作者：

舒然

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关键词：

李细菌性穿孔病致病菌环介导等温扩增技术病害防控

授予学位：

硕士

学科专业：

植物保护

导师：

尹显慧

学位年度：

2022

学位授予单位：

贵州大学

语种：

中文

中图分类号：