草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种重要入侵害虫，该虫2019年在我国云南首次发现，现我国26个省、市的1518个县区都发现了该虫的危害，对我国的粮食尤其玉米生产造成了巨大的损失。目前，草地贪夜蛾的防治主要依赖化学农药，草地贪夜蛾在国外已经对多种化学农药产生了抗药性，我国草地贪夜蛾的抗药性也在不断上升。因此亟需寻找安全有效的靶标位点，以解决草地贪夜蛾绿色防治和抗药性等问题。海藻糖是昆虫的“血糖”，在昆虫的能量供给、抗逆应激和几丁质代谢等生理过程中发挥重要作用，因此调控昆虫体内海藻糖代谢的相关基因被认为是农药作用的潜在靶标，具有重要的研究意义。本研究以草地贪夜蛾为实验对象，运用RT-PCR技术克隆了草地贪夜蛾体内的海藻糖合成酶基因（SfTPS），运用实时荧光定量（RT-qPCR）技术分析了SfTPS的时空表达模式；通过RNAi和海藻糖酶抑制剂（井冈霉素validamvcin）的介导，对草地贪夜蛾体内的海藻糖代谢及其对几丁质合成过程的调控机制进行了深入研究。主要研究结果如下： 1.草地贪夜蛾SfTPS的克隆、序列分析及表达谱 克隆获得草地贪夜蛾SfTPS的cDNA序列共计2571bp，将其命名为SfTPS（GenBank登录号:MT920672），预测SfTPS的开放阅框（ORF）长2481bp，共计编码826个氨基酸。SfTPS具有TPS和TPP两个保守的功能结构域。SfTPS的分子量为92.70kD，等电点（pI）为6.45。SfTPS无信号肽和跨膜结构域。SfTPS具有O-糖基化位点18个，N-糖基化位点3个。α-螺旋（α-helix），β-折叠（β-sheet）和无规则卷曲（random coil）在SfTPS二级结构中的占比分别为38.14%，12.23%和48.55%。SfTPS的三级结构为同源二聚体（homo-dimer）。系统发育分析表明，SfTPS与鳞翅目昆虫TPS的亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期等低龄发育阶段的相对表达量较低，SfTPS在6龄幼虫期、蛹期和成虫期等高龄发育阶段的相对表达量较高；且SfTPS在草地贪夜蛾5龄幼虫脂肪体中的相对表达量最高，在体壁和中肠中的相对表达量较低。研究结果补充了草地贪夜蛾的基础分子数据，为进一步研究草地贪夜蛾体内SfTPS的生物学功能奠定了理论基础。 2.运用RNAi技术揭示了海藻糖代谢对草地贪夜蛾几丁质合成的调控作用 运用RNAi技术沉默草地贪夜蛾体内海藻糖合成酶（TPS）、可溶型海藻糖酶（TRE1）和膜结合型海藻糖酶（TRE2）基因的mRNA表达，研究海藻糖代谢相关调控基因在草地贪夜蛾海藻糖代谢及其对几丁质合成的调控机制。结果表明，注射不同的dsRNA后，草地贪夜蛾被干扰目的基因的mRNA表达水平显著降低，并且草地贪夜蛾体内TPS、TRE1和TRE2等海藻糖代谢调控基因的转录水平能互相影响，表现为干扰TPS的表达，抑制TRE2的mRNA表达，干扰单个TRE可诱导另一个TRE表达互补上升。干扰不同的海藻糖代谢调控基因后，造成不同发育阶段草地贪夜蛾的存活率出现不同程度的降低，而且草地贪夜蛾出现预蛹期脱水异常、蛹重降低、畸形蛹和成虫翅发育畸形等异常表型。与注射dsGFP相比，注射dsTRE1或dsTRE2后草地贪夜蛾体内TRE1的活性受到极显著抑制，TRE2活性在注射dsTPS和dsTRE2后受到极显著抑制。RNAi技术沉默草地贪夜蛾体内TPS、TRE1和TRE2的mRNA表达后，破坏了草地贪夜蛾体内海藻糖和葡萄糖的动态转化平衡。注射dsTPS和dsTRE124h后，草地贪夜蛾体内CHSA的表达量上调；注射dsTRE148h后，草地贪夜蛾体内CHSA的相对表达量降低。草地贪夜蛾体内CHSB的表达量在注射dsTRE124h后极显著高于对照（dsGFP）；草地贪夜蛾体内CHSB的表达量在dsTPS、dsTRE1和dsTRE2处理48h后均受到抑制。草地贪夜蛾体内几丁质的含量在注射dsTRE1或dsTRE2后显著减少。表明干扰草地贪夜蛾体内调控海藻糖代谢相关基因的mRNA表达，可破坏草地贪夜蛾体内正常的海藻糖代谢，从而调控下游几丁质合成酶基因的mRNA表达，进一步影响几丁质的合成。研究结果为研发以草地贪夜蛾海藻糖代谢相关的调控基因作为分子靶标位点的新型农药提供了理论基础。 3.井冈霉素介导海藻糖代谢对草地贪夜蛾几丁质合成的调控作用 用注射法将海藻糖酶抑制剂（井冈霉素）注射到草地贪夜蛾4龄幼虫体内，首先研究不同浓度的井冈霉素溶液对草地贪夜蛾的致死率，然后筛选出一个对草地贪夜蛾致死率在30-50％的井冈霉素有效致死浓度，再用井冈霉素有效致死浓度处理草地贪夜蛾后，进一步研究井冈霉素对草地贪夜蛾生长发育产生的持续性影响，并对草地贪夜蛾体内海藻糖代谢和几丁质合成发生的变化进行深入研究。结果表明，与注射H2O的对照相比，草地贪夜蛾经不同浓度的井冈霉素溶液处理后出现了不同程度的死亡，且死亡率随井冈霉素浓度的升高而升高；其中，草地贪夜蛾经0.07mg/μL的井冈霉素溶液处理24h和48h后的死亡率分别为35.56％和42.22％，可作为井冈霉素有效致死浓度。0.07mg/μL的井冈霉素溶液处理会造成草地贪夜蛾在4龄幼虫期出现发育迟缓、蜕皮异常而死亡，但对草地贪夜蛾后续发育阶段的存活率、蛹重和表型未造成持续性影响。注射0.07mg/μL的井冈霉素溶液24h后草地贪夜蛾体内TRE1和TRE2的活性受到极显著抑制。草地贪夜蛾体内TRE1和TRE2的表达量分别在0.07mg/μL的井冈霉素溶液处理48h和24h后出现上调。0.07mg/μL的井冈霉素溶液处理24h后草地贪夜蛾体内的海藻糖含量增加，葡萄糖含量减少。注射0.07mg/μL的井冈霉素溶液24h和48h后抑制了草地贪夜蛾体内CHSA和CHSB的mRNA表达，但0.07mg/μL的井冈霉素溶液处理72h后草地贪夜蛾体内几丁质的含量与对照差异不显著。表明海藻糖酶抑制剂（井冈霉素）可有效抑制草地贪夜蛾体内海藻糖酶的活性，破坏草地贪夜蛾体内海藻糖和葡萄糖的动态转化平衡，进一步影响下游几丁质合成酶基因的mRNA表达。研究结果为利用海藻糖酶抑制剂作为草地贪夜蛾的防治手段奠定了理论基础。
NETL
