摘要
大脑是人体内最复杂精细的器官，行使语言、情绪、抽象思维等高级功能。大脑行使的高级功能依赖于神经元间的信息传递，主要通过神经元间的突触(synapses)连接进行。突触可按传递方式分为化学突触(chemical synapses)和电突触(electrical synapses)两大类。有研究表明，大脑皮层发育早期，神经元间的连接方式以电突触为主;随着发育进行，电突触逐渐减少并被化学突触取代。电突触由相邻胞膜上的缝隙连接半通道六聚体对接形成，允许电流双向通过，也是众多信号分子的通道。研究发现电突触介导小鼠发育早期的皮层神经元的同步化放电，敲除电突触的连接蛋白26(connexin26)降低这种同步化放电程度，且影响兴奋性神经元树突生长和化学突触生成。 目前，狂犬病毒单次跨突触标记，mGRASP(mammalian green fluorescence protein reconstitution across synaptic partner)荧光标记，i-BioID生物素标记等技术被广泛运用于化学突触的研究中，然而高效的电突触标记方法却十分匮乏。电突触研究中，普遍使用的是染料扩散法，多通道膜片钳记录，电子显微镜成像或者直接融合荧光蛋白，以及最近开发的遗传工具如PARIS(pairing actuators and receivers to optically isolate gap junctions)。但是在这类方法中，有些会造成细胞损伤（染料法，膜片钳和电镜），有的标记效率和分辨度较低(如荧光蛋白融合和PARIS)。虽然皮层神经元中电突触表达丰富，但存在周期短暂，上述方法很难研究电突触对于皮层发育中的神经元的影响。 因此，本研究从Pup-IT(pupylation-based interaction tagging)方法中获得启发，设计出基于类泛素蛋白Pup相互作用的标记方法PUPIL(pupylation-based interaction labeling)。类泛素化是一种原核生物翻译后蛋白修饰系统，连接酶PafA可将类泛素蛋白PupE共价连接到相邻蛋白的赖氨酸上。实验中将Cx26-PafA-IRES-EGFP和BCCP-PupE-IRES-EGFP质粒，于小鼠E13.5-14.5天，通过胚胎电转入皮层神经祖细胞中。与游离状态的PafA对照组相比，Cx26-PafA可催化产生特异的点状信号，经Cx26抗体免疫染色、免疫电镜和电生理记录验证，这些生物素点正是电突触存在的位置，表明PUPIL能够在小鼠发育皮层中有效且特异地标记短暂存在的电突触，且PUPIL在不同发育时期、不同亚细胞位置标记出电突触分布和数量变化情况。另一方面，基于临近蛋白标记原理，电突触形成的标记可持续保留至神经元成熟，经实验证明，这类印迹信号由早期的电突触催化产生。此外，我们发现PUPIL的印迹信号位于神经元的树突分支点，以及部分与化学突触蛋白共标，表明电突触可能与神经元树突生长和发育以及化学突触的形成有关联。利用显性抑制型DNCx26(dominant negative Cx26)在不影响电突触黏附功能的前提下，阻断发育早期电突触的通道功能，我们发现神经元中兴奋性化学突触密度减少，但树突发育并没有受到影响。 通过对PupE改造，将PupE与绿色荧光蛋白或者钙成像蛋白结合，我们发现PUPIL能在活体实验中标记小鼠皮层神经元电突触。此外，PUPIL同样适用于Cx36组成的电突触和化学突触的标记。 总而言之，PUPIL为皮层神经元的电突触研究提供了一种新的遗传标记方法，它的印迹作用可以用于研究短暂存在的电突触的生理功能。PUPIL具有强大的蛋白标记的能力，可根据不同的实验目的进行改造，在免疫电镜、活细胞成像中用于各类蛋白质的标记。
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