摘要
神经退行性疾病是一类进行性丢失神经元结构与功能，直至神经元死亡的疾病。越来越多的证据表明神经退行性疾病如多发性硬化症、帕金森病的遗传因素所占比例很小，而外界环境对这类疾病的发病越来越重要。胃肠道是人体与外界环境接触的一个巨大界面。越来越多的研究表明肠-脑轴在神经退行性疾病中扮演重要角色。对于多发性硬化症而言，肠道菌群可以产生不同的代谢物影响外周免疫细胞反应或中枢神经系统中胶质细胞的激活。对于帕金森病，肠道菌群可以通过产生短链脂肪酸影响小胶质细胞的激活来影响神经元的存活。然而这些研究中的肠-脑轴实际上是肠道微生物-脑轴，忽略了肠道屏障在其中的作用。 肠道屏障位于肠道菌群与宿主接触的最前线，但对肠道菌群如何与肠道上皮细胞相互沟通却少有研究。前人的研究表明人类肠道细菌产生的代谢物可以激活多巴胺受体，其中绝大多数是多巴胺受体D2家族。为了探索肠道多巴胺系统与神经退行性疾病之间的关系，我们构建了肠道上皮细胞特异性敲除多巴胺受体D2的小鼠，并利用它解析肠道上皮的多巴胺系统与多发性硬化症和帕金森病之间的潜在关系。 首先，我们观察到多发性硬化症患者肠道中的多巴胺D2-样受体激动剂苯乙胺(Phenylethylamine，PEA)含量增加。且在健康人群中，女性肠道中的PEA含量显著高于男性。在模拟多发性硬化症的小鼠实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中，口服PEA使文献报道无雌雄差异的C57BL6小鼠出现性别差异。即口服PEA显著恶化雌性小鼠的EAE症状而对雄性小鼠无影响。由于PEA可以激活多巴胺受体D2家族，我们分别在肠道上皮细胞(IECs)中选择性的敲除Drd2（Drd2Vil1cKO），Drd3（Drd3vil1cKO）和Drd4（Drd4vil1cKO）。我们观察到只有Drd2选择性敲除显著减轻了雌性小鼠而不是雄性cKO小鼠的EAE临床症状。雌性Drd2vil1cKO小鼠的肠道中编码溶菌酶的lyz1基因相较于对照小鼠显著下调，而在雄性小鼠中则无明显差异。同时我们观察到与相比于健康对照，MS患者肠道中的溶菌酶活性显著增加，且该现象只存在于女性患者中。溶菌酶是一种抗菌酶，可以直接作用于肠道菌群，因此我们进行了16S rRNA-seq分析肠道菌群组成。结果显示雌性Drd2vil1cKO小鼠的肠道菌群与对照相比存在显著差异，而雄性小鼠基因型之间则无显著差异。广谱抗生素饮水给药显著抑制了雌性Drd2vil1cKO小鼠的EAE症状的缓解，而雌雄小鼠同笼饲养成功地改变了雄性动物的肠道微生物群，并使雄性Drd2vil1cKO小鼠EAE症状得到缓解，表明肠道上皮细胞选择性敲除Drd2造成的EAE临床症状减轻依赖于肠道菌群。为了探讨菌群是如何影响脊髓中的病理变化的，我们对粪便、血液和脊髓组织进行了非靶向代谢组学分析，结果显示，N2-乙酰基-L-赖氨酸在Drd2vil1cKO小鼠脊髓组织中显著减少，该物质在体外细胞培养体系和体内实验中均能抑制小胶质细胞参与的炎症反应。综上所述，我们发现了肠道上皮细胞Drd2以一种肠道微生物群依赖的方式塑造对自身免疫性疾病发病过程的性别二态性。 利用MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine)诱导的小鼠帕金森病模型，我们探讨了肠道上皮的多巴胺系统在帕金森病发病过程中的作用。我们观察到在MPTP注射后，肠上皮细胞中Drd2（而不是Drd4）的选择性基因缺失可导致黑质多巴胺能神经元丢失和纹状体多巴胺的水平降低加剧，同时伴有小胶质细胞的更明显的激活。此外，与对照组动物相比，MPTP注射后，Drd2vil1cKO小鼠的肠道微生物群中产生琥珀酸的Alleoprevotella的丰度明显下降，与此相反，体外培养的人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)和MPTP诱导的小鼠帕金森病模型给予琥珀酸盐，可以明显地减少由MPTP所引起的多巴胺能神经元丢失。琥珀酸盐的这一神经保护作用与它的维持神经元的线粒体膜电位稳定有关。以上实验结果表明，在MPTP神经毒性的条件下，肠上皮细胞中Drd2可通过影响肠道菌群的代谢物，进而改变中脑多巴胺能神经元的存活。 除此之外，我们对从2个中心收集到的25个健康对照和18个PD病人肠道活检组织样品进行了转录组测序。测序结果提示，PD患者肠道屏障相关基因表达水平下降，与免疫稳态相关的基因也发生显著改变。经验证，发现Clca1在mRNA和蛋白水平均存在明显的下调。 这些结果揭示了肠道多巴胺受体和肠道菌群代谢物参与到神经退行性疾病的发生发展中，有望为神经退行性疾病的诊断和治疗提供新的靶点和手段。
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