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大叶骨碎补中阿洛糖苷合成酶相关基因的功能鉴定
岳改月1
作者信息
摘要
目的:本课题以D-阿洛糖的酶法糖基化修饰所需的核苷二磷酸阿洛糖（NDP-阿洛糖）活性供体的酶法合成为根本目的，从文献报道的宽泛性酶以及药用植物大叶骨碎补中挖掘能够催化NDP-阿洛糖生成的酶。我们对植物大叶骨碎补中NDP-阿洛糖补救合成路径(salvage pathway)中所需的激酶和糖核苷转移酶基因进行探索，以期为NDP-阿洛糖的生物合成及应用奠定基础。 方法:本课题提取了植物大叶骨碎补RNA，基于转录组测序技术，利用Blast分析和生物学软件Bioedit从大叶骨碎补转录组数据中筛选具有激酶和糖核苷转移酶功能的基因并进行进一步生物信息学分析。然后通过基因克隆、异源表达等生物手段来获得纯酶，进一步对酶进行活性分析，达到对未知基因进行功能鉴定的目的。 结果:从文献报道中合成5个激酶、1个磷酸变位酶和2个糖核苷转移酶基因，遗憾的是这些宽泛性酶并没有实现NDP-阿洛糖的生成，实验结果从侧面说明了这些酶的底物谱有限;从大叶骨碎补的转录组数据中筛选出具有5个激酶功能的未知酶，成功表达和纯化出3个，其中1个鉴定为半乳糖激酶，并对其进行了酶学性质的研究;从大叶骨碎补的转录组数据中筛选出4个具有糖核苷转移酶功能的未知酶，成功表达和纯化出其中2个，分别鉴定为ADP-葡萄糖磷酸化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。二者均具有底物宽泛性，至于是否能够识别阿洛糖-1-磷酸的催化生成ADP-阿洛糖或UDP-阿洛糖，需要进一步验证。 结论:本研究首次对NDP-阿洛糖的补救合成途径所需的激酶和糖核苷转移酶进行探索，从中鉴定出了半乳糖激酶，ADP-葡萄糖磷酸化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，三个酶在不同NDP-糖活性供体的生成中发挥各自重要的功能，丰富了大叶骨碎补基因库信息。其中，ADP-葡萄糖磷酸化酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的发现为ADP-半乳糖、ADP-甘露糖和UDP-甘露糖的合成机制（未见报道）提供方向;除此之外，ADP-葡萄糖磷酸化酶具有很强的底物杂泛性，具有很大的潜力实现NDP-阿洛糖的生成。
关键词
大叶骨碎补/核苷二磷酸阿洛糖/补救合成/半乳糖激酶/ADP-葡萄糖磷酸化酶/UDP-葡萄糖焦磷酸化酶/基因鉴定引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
药学（专业学位）导师
孙稚颖；王伟学位年度
2022学位授予单位
山东中医药大学语种
中文中图分类号
S5