摘要
生物碱是天然产物中的一大类，具有广泛的生物活性，也是天然产物研究比较热门的领域之一。目前很多生物碱仍然从植物中提取获得，由于植物资源的匮乏，长期的人为开采使得这些植物资源处于濒危的境地，亟需寻求新的方式获得这些具有重要医药价值的生物碱。合成生物学的出现和发展，为植物天然化合物的生产提供了绿色、可持续和可人为操控的新策略。但应用合成生物学技术的关键是天然化合物合成途径的解析和异源途重构，尤其是合成途径中关键基因元件的挖掘。一叶萩生物碱和石松生物碱是生物碱中的两类，这两类中的一叶蔌碱和石杉碱甲分别是治疗小儿麻痹后遗症和老年痴呆症的药物，目前这两个生物碱合成途径相关的基因报道还非常少，因此我们对这两个生物碱的生物合成途径进行了研究。 我们实验室长期以来对具有生物活性的生物碱进行研究。在对一叶蔌碱生物合成途径研究的过程中，我们从一叶蔌植物茎叶总生物碱提取物中发现了一个结构新颖的维生素C化的一叶蔌生物碱fluesuffineA，因其结构的新颖性，我们对该生物碱的生物合成途径尝试进行解析;运用前体喂养、蛋白质组学和转录组学等技术，找到了参与合成fluesuffineA的酶FsBBE，FsBBE是目前发现的第一个参与一叶蔌生物碱生物合成途径的酶，并证明了fluesuffine A是由FsBBE催化allosecurinine和L-ascorbic acid或dehydroascorbic acid缩合而成的，因此，FsBBE还是一个参与维生素C化天然产物生物合成途径的酶。催化机制研究发现，FsBBE首先催化allosecurinine生成不稳定的烯胺中间体124，然后124即可以FsBBE酶促的方式，高效的与L-ascorbic acid或dehydroascorbic acid缩合生成fluesuffine A，也可以以自发的方式，与L-ascorbic acid或dehydroascorbic acid低效的缩合生成fluesuffine A。在研究清楚FsBBE的催化机制后，我们又利用FsBBE以allosecurinine和isoascorbic acid为底物合成了fluesuffine A的差向异构体fluesuffine B，合成的fluesuffine B进一步证明了我们推测的FsBBE催化机制的正确性。生物活性测试发现，化合物fluesuffine A和B对SF-268、MCF-7、HepG-2、A549和LX-2五种肿瘤细胞株都显示显著的细胞生长抑制活性。 对石杉碱甲生物合成途径解析的研究中，我们以龙骨马尾杉为研究材料，首先对龙骨马尾杉进行体外繁殖研究，经过多种培养条件的探索尝试后，最终得到龙骨马尾杉的体外繁殖体系，该体外繁殖体系为龙骨马尾杉的可持续利用打下了基础。随后我们对得到的该体外繁殖体系材料的不同组织石杉碱甲相对含量进行了分析，因为根、茎、叶、茎尖和新茎尖5个组织石杉碱甲含量具有显著差异，我们对龙骨马尾杉进行了三代转录组测序和5个不同组织的二代转录组测序，并对得到的转录组数据进行分析，得到了一些候选的石杉碱甲合成途径cytochrome P450(CYP450)基因，对候选的基因进行酵母的体外功能验证，遗憾的是未能获得有功能的基因。另外，运用已经报道的Huperzia serrata来源的HsLDC和HsCAD，以及Anisodus acutangulus来源的AaPKS或Phlegmariurus carinatus来源的PcPKS1基因，我们成功构建了4-（2-piperidyl）-acetoacetate(4PAA)烟草表达体系。 本研究综合运用多种生物学方法，对一叶蔌生物碱和石松生物碱尝试进行解析。在一叶蔌生物碱生物合成途径的研究中，发现了一个新的一叶蔌生物碱，同时也是新的维生素C化的天然产物fluesuffine A，找到了合成该新化合物酶FsBBE，第一次对一叶蔌生物碱生物合成途径进行了解析，验证了中间体124在一叶蔌生物碱生物合成途径中的存在，并用FsBBE合成了fluesuffine A的差向异构体fluesuffine B，这对差向异构体显著的抗肿瘤活性为药物的开发提供了新的前体化合物。在石杉碱甲合成途径解析中，发现了PcPKS1基因，证明了龙骨马尾杉具有4PAA的生物合成途径，也进一步验证了推测的石杉碱甲来源于4PAA的可能;而且构建了4PAA烟草表达体系，该体系将为接下来候选CYP450基因功能验证打下了基础。
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