摘要
挥发油是植物中重要的次生代谢产物，也是芳香类中药主要药用成分。紫苏挥发油是紫苏叶最主要的功效成份，有着优异的抗氧化、抗衰老、提高免疫系统、抗菌消炎、抑制肿瘤生长的作用。紫苏叶中单萜化合物类型丰富，根据主要单萜类型不同可将紫苏分为不同的化学型（Chemotype）。单萜化合物主要由单萜合成酶（Monoterpene synthase）催化形成。单萜合成酶是一类大的基因家族，尽管目前已有少量紫苏单萜合成酶的催化功能报道，但是尚缺乏系统研究。鉴定紫苏单萜合成酶的催化功能，利用代谢工程手段生产单萜化合物，对紫苏重要单萜化合物的规模化生产具有重要意义。 因此，本研究课题组收集43份紫苏为材料，通过对不同紫苏种质挥发油类型评价及两种主要挥发油化学型抑菌活性评价。并且，基于课题组前期4种化学型转录组及共表达分析的基础上，筛选并克隆4个单萜合成酶编码基因，分别通过大肠杆菌体内表达及体外酶活鉴定单萜合成酶的催化产物。具体研究结果如下： 1.紫苏种质资源挥发油含量分析。分别取18份叶用型和25份油用型紫苏苗期叶片，采用GC-MS挥发油成分进行检测，鉴定其挥发油类型。结果发现，在18份叶用型紫苏中，检测到11份紫苏醛型（perillaldehyde，PA）品种（61%），为供试叶用紫苏主要化学型。叶用型紫苏还鉴定到PK、PL、PT等化学型。25份油用型紫苏品种中包含8份紫苏酮型（perillaketone，PK）（32%），8份紫苏烯型（Perillene，PL）（32%），还包括PA、PP、PPA等化学型。 2.紫苏挥发油抑菌效果评价。基于功能活性报道较多的紫苏醛型、紫苏烯型挥发油，分别对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行抑菌效果评价。结果发现两种紫苏挥发油对供试菌种都有明显的抑制效果，尤其紫苏烯对沙门氏菌抑菌效果，100%浓度时抑菌效果高于阳性对照，可达到对照115%。两种紫苏挥发油良好的抑菌效果为紫苏抑菌类功能性产品开发提供理论支撑。 3.紫苏TPS基因克隆及生物信息分析。对前期4种化学型转录组及共表达分析鉴定到4个重要TPS编码基因（PfTPS28、PfTPS29、PfTPS85、PfTPS86）进行克隆。克隆的候选基因分别编码598、594、605、598个氨基酸，均含有萜类合成酶的两个保守结构域，TPSN/C端保守结构域。多序列比对和系统进化树分析显示，编码单萜合酶的TPS基因主要可聚为3类。其中，PfTPS86编码蛋白与已报道的紫苏香叶醇合酶聚类关系最近，它们编码蛋白同源性为100%。PfTPS28、PfTPS29、PfTPS85所编码的蛋白质与已报道紫苏芳樟醇合酶聚类关系最近，它们编码蛋白同源性为74%，73%，100%。 4.采用大肠杆菌体内表达验证候选TPS基因功能。采用原核表达载体pETDuet-1，以克隆获得4条TPS基因分别构建重组质粒。将包含重组质粒的大肠杆菌经发酵培养、菌液裂解、产物富集后通过气相色谱-质谱联用仪进行检测。结果发现PfTPS29、PfTPS28、PfTPS85主要催化产物是芳樟醇，次要催化产物是香茅醇，PfTPS86催化产物是香茅醇和香叶醇。 5.采用体外酶活进一步对TPS功能验证。将４条基因分别构建原核表达载体pET32a重组质粒，在大肠杆菌中进行孵育表达，对分离重组蛋白进行酶活鉴定。结果发现，以GPP为底物时，PfTPS28、PfTPS29、PfTPS85催化产生芳樟醇。PfTPS86催化产生香叶醇，与大肠杆菌体内表达结果一致。 本研究完成43份紫苏种质挥发油类型评价及两类化学型抑菌活性评价。在课题组前期挖掘到的基因中筛选出4个单萜合成酶编码基因，克隆4个单萜合成酶编码基因，进行简单生物学分析，并分别通过大肠杆菌体内表达及体外酶活鉴定了其功能，发现4个单萜合成酶编码基因是催化产生芳樟醇及香叶醇的重要TPS。研究结果为紫苏种质资源的挥发油开发及利用，以及紫苏单萜合酶的代谢工程利用提供了研究基础。
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