摘要
心力衰竭的发病率和死亡率目前仍高居首位，严重威胁人类健康。病理性心室重塑，包括心肌肥厚和纤维化，是多种心血管疾病导致心力衰竭的最后共同通路。已有研究报道，表观遗传调控，尤其是组蛋白赖氨酸甲基化修饰与心肌肥厚和纤维化密切相关。组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)可特异性去除组蛋白3(H3)第4位和第9位赖氨酸(K4和K9)的单双甲基，在胃癌，小细胞肺癌(SCLC)和急性粒细胞白血病(AML)等肿瘤中高表达。LSD1已成为抗肿瘤治疗的新靶点，干扰其表达或靶向抑制其活性均可显著抑制肿瘤的生长、侵袭和转移，多种LSD1特异性抑制剂，如GSK2879552，ORY-1001和TCP正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验。但LSD1功能抑制对心血管系统是否存在潜在的副作用目前并不完全清楚。鉴于此，本课题选择主动脉弓缩窄(TAC)诱导的压力超负荷模型探讨LSD1在心肌肥厚、纤维化乃至心力衰竭进程中的作用。 本课题主要研究内容及结果如下: 1.LSD1在心衰心脏中的表达情况及其体外干预研究 1.1LSD1在心衰心脏中的表达情况 首先采用免疫组织化学实验检测发现LSD1在扩张性心肌病(DCM)患者心脏中的蛋白表达水平明显高于正常(Donor)心脏。进而，采用C57BL/6小鼠，构建TAC诱导压力超负荷模型，结果显示，LSD1在TAC诱导心衰的心肌组织中蛋白表达量显著升高至假手术(Sham)组的1.33倍，同时伴随其修饰的底物H3K4me2和H3K9me2表达水平降低至49.4％和58.2％。此外，在上述TAC诱导心衰小鼠分离的心肌成纤维细胞(CFs)中发现，与Sham组相比，LSD1的蛋白表达亦明显升高，提示LSD1可能参与人和小鼠的心衰进程，并且可能与心肌纤维化密切相关。 1.2LSD1表达下调或活性抑制对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导新生大鼠心肌成纤维细胞活化的影响 分离新生大鼠心肌成纤维细胞(NRCFs)，采用AngⅡ诱导NRCFs活化，表现为collagenⅠ的蛋白水平显著升高。同时检测发现LSD1在活化的NRCFs中表达量亦显著升高。此外，应用分离的新生大鼠心肌细胞(NRCMs)，发现LSD1的表达量在AngⅡ诱导的肥大性心肌细胞中未见显著性变化。 进一步研究发现LSD1小干扰RNA(siRNA)介导的LSD1表达量敲低可显著减轻AngⅡ诱导的NRCFs中促纤维化标志蛋白α-SMA，collagenⅠ和collagenⅢ的表达。另一方面，发现应用LSD1特异性小分子抑制剂ORY-1001也可显著降低AngⅡ诱导的上述促纤维化因子的表达。上述结果表明，LSD1参与NRCFs的活化，其表达下调或活性抑制可显著逆转AngⅡ诱导的NRCFs活化。 2.活化心肌成纤维细胞特异性敲除LSD1对压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚和纤维化的调控作用及机制研究 2.1活化心肌成纤维细胞特异性LSD1条件性敲除小鼠的构建 前面实验结果提示LSD1可能发挥促纤维化作用。为了进一步探讨LSD1在体内心肌纤维化中的作用，本课题组构建了活化心肌成纤维细胞，即肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF)特异性LSD1条件性敲除(knockout，KO)小鼠。骨膜蛋白(periostin，编码基因Postn)，在正常的心脏组织中几乎不表达，只在心脏受损后活化的心肌成纤维细胞中表达。因此，采用在Postn基因外显子1区域插入有他莫昔芬诱导型MerCreMer cDNA(PostnMCM)的小鼠，同时，在该小鼠体内引入了Rosa26-Loxp-Stop-Loxp-RFP(R26RFP)报道基因去追踪所有肌成纤维细胞。将PostnMCM R26RFP小鼠与LSD1fl/fl小鼠交配，获得子代小鼠，应用尾部基因组DNA，通过PCR筛选获得阳性PostnMCM R26RFP LSD1fl/fl(MF KO)小鼠，并以PostnMCM R26RFP小鼠作为对照(Control).选用8周龄Control小鼠和MF KO小鼠，构建TAC模型，并于手术前48h将正常鼠粮更换为含有他莫昔芬的鼠粮，一直维持至实验结束。 在TAC模型后6周时，分离Control和MF KO小鼠心肌间质细胞，荧光显微镜下可见部分细胞带有红色荧光，经过流式分选，筛选出带有RFP标签的细胞，即肌成纤维细胞。Western blotting检测结果显示，LSD1在MF KO小鼠肌成纤维细胞中的表达量显著少于Control小鼠，提示活化心肌成纤维细胞，即肌成纤维细胞特异性LSD1条件性敲除(MF KO)小鼠构建成功。 2.2肌成纤维细胞特异性敲除LSD1对压力超负荷诱导的小鼠心肌肥厚和纤维化的影响及机制研究 采用Vevo2100超声系统分别检测Control和MF KO小鼠心功能。结果显示，TAC后6周时，与基础状态(Baseline)相比，Control小鼠的左心室重量(LV mass)明显升高，而MF KO小鼠的LV mass变化并不明显。TAC后20周时，与Baseline相比，Control小鼠心功能（射血分数EF％和短轴缩短率FS％）显著降低，MFKO小鼠心功能（EF％和FS％）与Control相比，得到明显改善。 TAC后6和20周时，组织学观察发现，Control小鼠心脏明显肥大，MF KO小鼠和Control相比，心肌肥厚程度明显缓解。此外，与Sham相比，Control小鼠的心重体重比(HW/BW)和心重胫骨长度比(H-W/TL)均明显升高，MF KO小鼠HW/BW和HW/TL则显著低于Control。TAC后20周时，Control小鼠肺重体重比(LW/BW)明显升高，出现肺水肿，MF KO小鼠LW/BW则显著低于Control，肺水肿情况得到有效改善。同时，与Sham相比，Control小鼠心脏组织中纤维化因子(α-SMA，collagenⅠ和collagenⅢ)的mRNA水平也明显升高，MF KO小鼠这三个纤维化因子的mRNA水平则显著低于Control.Masson和天狼星红染色显示，Control小鼠心肌出现明显纤维化，MF KO小鼠心肌纤维化程度要显著低于Control。HE染色显示，Control小鼠心肌细胞出现大量的细胞质空泡，一种心肌损伤的标志，MF KO小鼠心肌细胞排列相对整齐、完整，损伤程度明显轻于Control。这些结果表明整体动物水平肌成纤维细胞中LSD1特异性缺失能够显著缓解TAC诱导的心肌肥厚和纤维化反应，对心功能发挥保护作用。 接着，对肌成纤维细胞特异性敲除LSD1发挥心脏保护作用的相关机制进行探讨。RNA-seq分析显示，肌成纤维细胞中LSD1的缺失能显著抑制转化生长因子β(TGFβ)介导的纤维化相关通路。进一步用westem blotting检测发现LSD1下调能够显著逆转AngⅡ诱导TGFβ1的升高，Smad2和Smad3的磷酸化，以及p38，ERK和JNK的磷酸化。相反，在NRCFs中腺病毒介导的LSD1过表达则能够上调TGFβ1的蛋白水平，促进纤维化因子collagenⅠ和collagenⅢ的表达。此外，ELISA检测显示，siRNA介导的LSD1下调能明显地逆转AngⅡ诱导的TGFβ1的分泌。同时，间接共培养模型显示肌成纤维细胞中LSD1下调能够通过降低AngⅡ诱导的TGFβ1分泌来减轻肌成纤维细胞对心肌细胞产生的不良影响。以上结果可知，肌成纤维细胞中LSD1下调能够通过抑制TGFβ及其相关通路来发挥心脏保护作用。 3.心肌细胞特异性敲除LSD1对TAC诱导小鼠心功能损伤的影响及其机制研究 3.1心肌细胞特异性LSD1条件性敲除小鼠的构建 上述实验结果表明肌成纤维细胞中LSD1特异性缺失可以发挥抗心肌纤维化作用。为进一步探讨LSD1在心脏中的作用，又构建了心肌细胞(cardiomyocyte,CM)特异性LSD1条件性敲除小鼠，采用心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(Myh6)启动子区域插入有他莫昔芬诱导型Cre-ERT2cDNA的小鼠(Myh6Cre)，与本课题组构建的LSD1纯合子小鼠(LSD1fl/fl)交配，获得子代小鼠，应用尾部基因组DNA，通过PCR筛选获得阳性Myh6Cre LSD1fl/fl(CM KO)小鼠，并以Myh6Cre小鼠作为对照(Control)。选取8周龄Control小鼠和CM KO小鼠，腹腔注射他莫昔芬(30mg/kg/d)，连续5天，4周后检测发现，与Control小鼠相比，CM KO小鼠心脏组织中的LSD1蛋白表达水平显著下降，提示心肌细胞特异性LSD1条件性敲除(CM KO)小鼠构建成功。 3.2心肌细胞特异性敲除LSD1对TAC诱导心功能损伤的影响及机制研究 他莫昔芬诱导后4周时，心脏超声结果显示，与Control组相比，CM KO小鼠表现出轻微的心肌肥厚，具体为左心室室间隔厚度IVS)，左心室后壁厚度(LVPW)以及LV mass升高。同时，CM KO小鼠的HW/BW和HW/TL也高于Control.此外，WGA,HE和Masson染色显示，与Control组相比，CM KO小鼠心肌出现轻微的肥厚和纤维化。 他莫昔芬诱导后16周时，再次进行心脏超声和组织学检测，评价心肌细胞中LSD1长时间缺失对小鼠心功能的影响。发现，与Control相比，CM KO小鼠的心功能（EF％和FS％）下降，HW/BW和HW/TL以及心肌细胞横截面积和纤维化程度均升高。上述结果表明，基础状态下心肌细胞特异性敲除LSD1可以诱导轻微的心肌肥厚、纤维化以及心功能降低。 综上所述，本论文首次成功构建了肌成纤维细胞特异性LSD1条件性敲除(MF KO)小鼠和心肌细胞特异性LSD1条件性敲除(CM KO)小鼠。进而发现肌成纤维细胞特异性LSD1缺失可减轻TAC诱导的心肌肥厚和纤维化反应，在心肌重构中发挥保护作用，其机制可能与抑制TGFβ介导的纤维化相关通路有关;另一方面，心肌细胞特异性敲除LSD1在基础状态以及压力超负荷条件下均可诱导心室重构以及心功能降低，可能与下调CoREST和REST的蛋白表达相关。本论文首次报道，LSD1在肌成纤维细胞和心肌细胞中发挥不同的作用，这种作用值得更进一步的研究和探索，靶向肌成纤维细胞的LSD1抑制剂的研究开发具有一定的治疗心肌纤维化的意义。此外，在LSD1抑制剂的临床研究中，应该极其注意与心肌肥大和纤维化相关的不良事件的发生。
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