摘要
本研究旨在探讨CCDC67基因发挥抑癌作用的分子机制与下游关键基因CEP63在甲状腺乳头状癌中的生物学功能。本课题内容由以下四部分组成： 第一部分 CCDC67基因对PI3K/AKT/mTOR通路的调控效应研究 目的： 本部分研究旨在通过蛋白组学、转录组学测序技术来探索CCDC67基因过表达后带来的下游基因表达变化，初步解析CCDC67基因的抑癌机制。 方法： 1.构建慢病毒质粒，经过细胞转染后，利用嘌呤霉素筛选并构建CCDC67基因稳定过表达的甲状腺TPC-1细胞株。 2.利用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)蛋白组学技术对过表达CCDC67基因前后的TPC-1细胞株进行检测，分析该基因过表达前后蛋白水平表达的变化。利用Metascape对分析数据进行Reactome、CORUM、KEGG和GO数据库整合富集分析。 结果： 1.通过iTRAQ蛋白组学技术对过表达CCDC67前后的TPC-1细胞株进行检测分析，我们共发现差异表达肽段31307个，蛋白6000个。根据KEGG通路分析mTOR信号通路呈现出表达变化差异。 2.通过RIP-RNA-seq转录组组学测序技术对过表达CCDC67前后的TPC-1细胞株进行检测分析，共发现差异表达的circRNA1865个，其中上调1008个，下调857个;发现差异表达的lncRNA28213个，其中上调7554个，下调20659个;发现差异表达的mRNA84573个，其中上调3494个，下调4936个。Metascape整合富集分析发现，差异表达的circRNA的功能集中于细胞微管、细胞器、细胞骨架、细胞周期方面，同时可见PI3K-Akt通路、Cell cycle（细胞周期）、MAPK通路等出现差异富集。 结论： 过表达CCDC67在甲状腺乳头状癌中的功能呈现多样化。其功能可能涉及细胞周期的调控、细胞器的合成和微管组织中心形成等细胞生命活动的诸多方面。同时，CCDC67的过表达对PI3K/AKT/mTOR信号通路传导产生了一定影响，但PI3K与mTOR的表达呈现非一致性变化与某特定生物表型的关系仍有待进一步探究。 第二部分 CCDC67基因对细胞自噬的调控效应分析 目的： 尝试通过自噬作为另一个切入点探索CCDC67基因的功能机制，通过更完善的实验手段和方案来检测CCDC67基因对细胞自噬带来的影响。 方法： 1.取指数增长期的TPC-1、CCDC67OE、NC细胞株，转染过表达SensGFP-StuBRFP-LC3的慢病毒，24H后经嘌呤霉素筛选。取筛选后的细胞1×104/ml接种于96孔板中，加入Hochest-33342染色，并置于CQ1中进行三通道荧光扫描，计数对红、绿点计数计算比之后，评估自噬流水平。 2.利用细胞刮刀收集指数增长期的TPC-1细胞、CCDC67细胞及空载体转染细胞NC，生理盐水漂洗后，用1％的戊二醛固定30分钟后，制作玻片进行透射电镜观察及拍摄，标注细胞器结构，对自噬体(AP)与自噬溶酶体(ASS)进行计数。 结果： 1.自噬流监测结果显示，CCDC67过表达导致自噬通量增强，其中自噬相对红绿点计数显示自噬体向自噬溶酶体的动态转化过程（TPC-1vs.NC,p=0.9148;TPC-1vs.CCDC67OE,p=0183;CCDC67OE vs.NC,***p＜0.0481）。 2.经透射电镜观察：与TPC-1组和阴性对照组相比，CCDC67OE组细胞中自噬体和自噬溶酶体数量明显增加(TPC-1vs.NC,p=0.891;TPC-1vs.CCDC67OE，p=0.001;CCDC67OE vs.NC，***p＜0.001.)。 结论： 在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株中，过表达CCDC67基因可引起细胞自噬水平显著升高。参考于正常甲状腺滤泡上皮细胞中较高的自噬水平，我们推测细胞自噬水平的升高是CCDC67基因逆转甲状腺乳头状癌恶性表型的重要一环。而细胞自噬作用的靶点，仍需要后续研究进行探索挖掘。 第三部分 CCDC67旁系同源基因CEP63的临床表达及肿瘤生物学功能探讨 目的： 首先关注了CEP63在甲状腺乳头状癌中的表达情况和生物学功能，同时在后续尝试探索CCDC67基因与CEP63基因直接是否存在可能的调控机制关系。 方法： 1.收集24例，2018年3月-5月郑州大学第一附属医院甲状腺外科甲状腺乳头状癌患者的癌灶组织，提取总RNA并进行RT-PCR，最后利用凝胶电泳验证CEP63和CCDC67基因表达产物在甲状腺乳头状癌组织中的存在性。 2.利用Cas9/CRISPR技术，构建CEP63敲除的甲状腺乳头状癌细胞株，经嘌呤霉素筛选后，进行单克隆培养扩增，最后利用测序技术验证KO敲除位点、western blotting法验证CEP63KO效率。 结果： 1.24例甲状腺乳头状中，均检测出CCDC67与CEP63基因的mRNA表达。 2.成功利用Cas9/CRISPR构建了CEP63敲除的TPC-1细胞株CEP63KO，并通过嘌呤霉素筛选和单克隆培养获得了2个与14个碱基缺失的稳定敲除的细胞株。随后，KO效率被测序和western blotting验证。 结论：CEP63基因在甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1的恶性生物学维持中起到至关重要的作用，其敲除可明显抑制肿瘤细胞周期进程和细胞活动。这一点，与其旁系同源基因CCDC67呈现出完全不同的生物学功能。这些关于CEP63的生物学表型的数据也就证明CEP63基因主导的MCD中心体复制途径，是甲状腺乳头状癌细胞复制所需中心体的主要、甚至唯一合成途径。 第四部分 CCDC67基因过表达对CEP63基因的表达调控及机制分析 目的： 尝试挖掘了前三部分内容的关系，分析它们内在的联系与更深层的机制，即CCDC67基因是如何对CEP63基因表达的实现调控的。 方法： 1.另收集21例，2018年9月-11月郑州大学第一附属医院甲状腺外科甲状腺乳头状癌患者的癌与癌旁非癌组织，提取总RNA并进行Realtime-PCR，检测CCDC67基因、CEP63基因的表达水平。同时，分析不同临床病理分期的甲状腺乳头状癌患者的癌与癌旁组织中CCDC67基因与CEP63基因的表达关系。 2.利用Western-blot法检测甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1、甲状腺乳头状癌中BRAF V600E突变细胞株B-CPAP与BRAF V600E非突变株TPC-1中的CCDC67基因与CEP63基因表达情况。 3.利用Western-blot法检测CCDC67基因过表达前后，TPC-1细胞株中CEP63的表达情况，结果采用ImageJ进行灰度分析。 结果： 1.分析21例PTC患者及其周围正常组织的CCDC67和CEP63的mRNA表达发现：在PTC组织中CEP63的表达显著增加，而在其周围正常组织中CEP63的表达显著减少。而CCDC67的表达恰恰相反。此外，在PTC组织中CEP63的表达高于CCDC67，而在癌旁正常组织中CEP63的表达相对低于CCDC67(CEP63∶PTCvs.Normal tissue,p=0.0021;CCDC67∶PTC vs.Normal tissue,p=0.0247;Normaltissues：CEP63vs.CCDC67,p=0.0145;PTC∶CEP63vs.CCDC67,p=0.0047)。 2.使用蛋白免疫印迹分析CEP63和CCDC67基因在细胞系中的表达(TPC-1/B-CPAP/Nthy-ori3-1)发现，CEP63在TPC-1和B-CPAP细胞系中，相较于CCDC67基因显示出较高的表达水平，但其灰度统计结果分析只有TPC-1细胞中的差异具有显著性(TPC-1：CEP63vs.CCDC67,p=0.001;B-CPAP∶CEP63vs.CCDC67，p=0.289;Nthy-ori3-1：CEP63vs.CCDC67,p=0.930)。 结论： 在甲状腺乳头状癌中，CEP63的高表达与CCDC67的低表达水平存在一定联系。CCDC67基因的过表达可引起CEP63的表达下降，进而实现逆转TPC-1细胞的恶性肿瘤生物学特征。通过雷帕霉素、巴弗洛霉素A1干预自噬水平后，CEP63蛋白的表达亦呈现出与自噬水平相反的变化，说明CEP63蛋白表达是受到细胞自噬调节的。结合前述部分的结果，我们不难得出，CCDC67基因是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控细胞自噬，进而降解CEP63蛋白以减少其在细胞内的累积的。这也就说明，在甲状腺乳头状癌中，两个中心体复制的途径DD途径对MCD是存在抑制效应的，而这种抑制效应丢失和MCD复制途径的主导，很可能是甲状腺乳头状癌发生的关键环节。
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