摘要
本文从以下四部分进行阐述： 第一部分LMK-235对食管鳞癌细胞功能的研究及其转录组学分析 目的:研究LMK-235对食管鳞癌细胞增殖功能及基因表达谱的影响。 方法：(1)通过CCK-8实验检测LMK-235对食管鳞癌细胞增殖功能的影响及药物作用半数抑制浓度(IC50)。 (2)采用EdU染色、流式细胞周期及凋亡实验检测LMK-235对食管鳞癌细胞KYSE150增殖、周期及凋亡的影响。 (3)通过Western Blot实验检测LMK-235对食管鳞癌细胞KYSE150组蛋白乙酰化修饰（H3k27ac、H3k14ac和H3k9ac）、HDAC4和HDAC5蛋白表达的影响。 (4)利用转录组测序技术（RNA-Seq）分析LMK-235对食管鳞癌细胞KYSE150基因表达谱的影响;通过基因集富集分析(GSEA)和KEGG通路富集分析，探讨药物发挥作用的潜在机制。 结果：(1)LMK-235对5种食管鳞癌细胞均具有明显细胞毒性，且呈剂量依赖性;其中KYSE150细胞相对最敏感，IC50为0.824μm。 (2)LMK-235明显抑制食管鳞癌细胞KYSE150增殖、诱导G1期阻滞及凋亡：与对照组相比，EdU阳性率降低41.54％（t=-10.51，p=8.94e-03），G0/G1期细胞比例增加1.00倍(t=8.75，p=1.3e-02)，AnnexinV阳性细胞的比例增加5.39倍(t=7.12，p=1.9e-02)。 (3)LMK-235明显增强KYSE150细胞组蛋白乙酰化修饰水平，同时降低HDAC4和HDAC5的表达;其中H3K27ac的变化最明显，表达量与对照组相比升高6.38倍（t=11.65，p=2.69e-06）。 (4)LMK-235处理后，KYSE150细胞基因表达谱发生明显改变：包括981个显著上调的基因，752个显著下调的基因;GSEA和通路富集分析显示这1733个显著改变的基因这要参与细胞增殖相关通路。 小结:(1)LMK-235明显抑制食管鳞癌细胞增殖、诱导G1期阻滞和细胞凋亡。 (2)LMK-235通过增强细胞组蛋白乙酰化修饰水平，改变基因表达谱，从而发挥抗肿瘤增殖作用。 第二部分LMK-235抗食管鳞癌靶基因筛选 目的:综合公共数据库食管鳞癌相关数据，筛选LMK-235抗食管鳞癌增殖靶基因;并评估该靶基因与患者临床参数之间的关系。 方法：(1)以GEO数据库食管鳞癌微阵列芯片GSE20347、GSE23400、GSE44021、GSE38129和GSE75241为研究对象，分析食管鳞癌差异表达基因。 (2)综合LMK-235显著调控的1733个基因和食管鳞癌差异表达基因，初步筛选药物作用潜在的促癌和抑癌靶基因。 结果：(1)食管鳞癌芯片联合分析共鉴定出1301个显著差异表达基因，包括634个癌组织显著上调基因和667个显著下调基因。 (2)综合LMK-235显著调控的1733个基因和1301个食管鳞癌差异表达基因，初步筛选出药物作用潜在的61个促癌和84个抑癌靶基因。 小结:(1)促癌基因TNS3在食管鳞癌中高表达，且与患者恶性临床参数正相关。 (2)LMK-235靶向抑制促癌基因TNS3发挥抗食管鳞癌增殖作用。 第三部分TNS3促进食管鳞癌增殖的机制研究 目的:研究促癌基因TNS3对食管鳞癌细胞增殖功能的影响及其机制。 方法：(1)以TCGA数据库33种癌症转录组数据为研究对象，分析TNS3与增殖细胞核抗原Ki-67(MKI67)的相关性。 (2)通过免疫组织化学染色实验，分析TNS3在是食管鳞癌患者中的表达及其与患者预后和临床参数之间的关系。 (3)采用siRNA技术敲低TNS3的表达，通过EdU染色检测该基因对食管鳞癌细胞增殖功能的影响。 (4)构建含shTNS3(#1，#2)慢病毒骨架质粒，通过慢病毒包装技术构建TNS3稳定敲低细胞系KYSE150（含对照），利用食管鳞癌CDX皮下荷瘤小鼠模型进行体内功能验证;通过免疫组织化学染色实验，检测TNS3下调对移植瘤组织中PI3K/AKT信号通路分子表达的影响。 结果：(1)TNS3与MKI67在13种肿瘤组织呈显著正相关，且食管鳞癌中相关性最强(r=0.36，p=7.53e-04)，但在食管腺癌中相关性不明显。 (2)TNS3在食管鳞癌组织中高表达（LogeWwilcoxon=8.24，p=1.25e-11），且与患者cTNM（Kendall''sτ-b=0.40，p=2.22e-08）和病理组织分级(Kendall''sτ-b=0.42，p=3.14e-09）均呈正相关;高表达提示不良预后（x2=7.10，p=7.0e-03;图3.4B）。 小结:(1)TNS3在食管癌中发挥促增殖作用，且存在鳞癌组织特异性，其高表达提示不良预后。 (2)过表达TNS3促进肿瘤细胞增殖，可能是通过激活PI3K/AKT信号通路所导致的。 第四部分LMK-235靶向超级增强子TNS3-SE在抗食管鳞癌 增殖中的表观机制 目的:解析LMK-235靶向超级增强子TNS3-SE在抗食管鳞癌增殖中的表观机制，为表观靶向治疗的临床转化提供理论依据。 方法：(1)以GEO数据库食管鳞癌(GSE76859、GSE106433、GSE106563、GSE155183和GSE166231)和腺癌(GSE132680)H3K27ac ChIP-seq数据为研究对象，采用ROSE算法鉴定TNS3相关超级增强子(TNS3-SE)并查看其分布特征，同时查看转录因子p63、BRD4、CTCF及SOX2在该区域内的富集强度。 (2)通过H3K27ac ChIP-Seq实验，检测LMK-235对食管鳞癌细胞KYSE150全基因组范围内乙酰化修饰，和超级增强子及其相关基因的影响。 (3)以TCGA数据库食管癌（包括鳞癌和腺癌）ATAC-Seq数据为研究对象，查看TNS3-SE范围内染色质开放程度，同时采用Pearson相关系数评估鳞癌TNS3-SE范围内平均染色质开放程度与TNS3表达的相关性。 (4)综合数据库分析结果，根据ChIP-seq实验TNS3-SE范围内narrowPeak分布，划分组分增强子。 (5)构建含组分增强子的荧光素酶报告质粒（含对照），共转染参照质粒pRL-TK，通过双荧光素酶报告实验筛选TNS3-SE核心组分增强子。 结果：(1)TNS3-SE在食管鳞癌细胞中普遍存在，且H3K4me1、SOX2及CTCF在该区域富集，但食管腺癌该区域内H3K27ac少量富集，未鉴定出超级增强子。 (2)ChIP-Seq测序结果表明，超级增强子相关基因的表达量，普遍高于普通增强子或非增强子相关基因，且对LMK-235敏感性最高(H=644.92，p＜2.22e-16);LMK-235抑制KYSE150细胞TNS3-SE的活性。 (3)食管鳞癌组织中TNS3-SE处于染色质开放结构域，但食管腺癌该区域染色质开放程度较低。 (4)TNS3-SE促进TNS3的转录，发挥作用的核心组分是E3增强子，其相对荧光强度是对照组的20.76倍(p=6.09e-10，Tukey HSD)。 (5)JASPAR数据库预测结合ChIP-Seq测序Motif分析，推测TNS3-SE富集的转录因子是AR、CTCFL、NEUROG2、THAP1、ZNF768和NR4A1。 (6)敲除TNS3-SE下调KYSE150细胞EdU阳性率，与对照组相比降低45.54％(t=-17.24,p=1.32e-04)。 小结:(1)超级增强子TNS3-SE是食管鳞癌特异增强子。 (2)LMK-235靶向抑制TNS3-SE的活性，下调促癌基因TNS3的表达，从而抑制食管鳞癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。 总结:本研究首先通过细胞实验明确LMK-235对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用，随后通过转录组测序技术研究药物处理对细胞基因表达谱的影响，采用GSEA和通路富集分析发现药物激活增殖表观通路。综合GEO数据库食管鳞癌差异分析结果，初步筛选出药物作用潜在的61个促癌和84个抑癌靶基因，从中挑选出10个候选基因进行siRNA文库筛选，选择对增殖功能影响最明显的基因TNS3;生物信息学分析表明该基因与食管鳞癌患者临床恶性表型呈正相关;LMK-235下调TNS3的表达，但对Het-1A没有明显影响。进一步利用免疫组织化学染色评估TNS3的表达与患者预后的关系，发现该基因高表达提示不良预后;体内外细胞实验表明该基因促进细胞增殖。通过H3K27ac ChIP-Seq实验证明LMK-235抑制食管鳞癌细胞TNS3-SE的活性;该超级增强子通过激活TNS3的转录，促进细胞增殖。本研究阐明了LMK-235靶向超级增强子TNS3-SE抗食管鳞癌的表观机制，有助于推进该领域相关临床试验，为临床转化提供理论依据。
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