摘要
鱼尼丁受体（RyRs）是位于内质网膜上的钙离子通道，在肌肉的兴奋收缩耦联中发挥重要作用。RyRs是重要的杀虫剂和药物靶标，与多种害虫的防治以及肌肉相关疾病的治疗息息相关。因此，针对RyR靶标的分子机制和药效机理研究有着重要的理论意义和应用价值。 昆虫RyR是双酰胺类杀虫剂的作用靶标。双酰胺类杀虫剂是目前世界上销售量最大的杀虫剂品种之一，但由于靶标药剂复合物结构的缺失，严重阻碍了对双酰胺作用机制的理解和基于结构的杀虫剂理性设计。近年在全球多个国家发现位于害虫RyR上的突变，已造成对双酰胺类杀虫剂超过千倍的抗药性，严重危害了现有杀虫剂的效能，对许多国家的食品安全构成威胁，而抗性产生的分子机理仍不明确。本课题成功解析了首个哺乳动物RyR与双酰胺类杀虫剂结合的复合物冷冻电子显微镜结构，分辨率达到3.8?。电镜结构清晰揭示出代表性双酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺（CHL）结合于RyR通道的电压感受功能域。CHL通过拉动S4-S5链接螺旋，引起离子通道孔区的开放，从而造成钙离子的持续释放，促发肌肉麻痹，达到杀虫效果。结合细胞钙离子荧光实验、基因编辑突变果蝇实验和定量计算生物学分析，验证了CHL与RyR的结合方式，明确了对靶标害虫选择性起关键作用的氨基酸残基，阐明了CHL高物种选择性的分子基础。电镜结构揭示虽然四个已知的抗性突变都位于CHL结合口袋附近，却以两种截然不同的形式影响口袋结构和杀虫剂结合：一类突变通过增大氨基酸侧链而造成空间位阻，阻碍CHL的进入和结合；而另一类突变通过减少氨基酸侧链与CHL的接触，降低CHL与RyR结合的亲和力。基于复合物结构，通过同源建模预测了另一类重要双酰胺类药剂氟苯虫酰胺（FLU）的作用模式。尽管两类双酰胺类杀虫剂在通道上作用位点相近，但其结合方式却不尽相同。 迄今为止已发现有超过500个人源Ry R突变会引起多种遗传性疾病，包括儿茶酚胺能多形性室性心动过速（CPVT）、特发性室颤（IFV）、恶性高热（MH）、中央轴空病（CCD）等，然而目前还没有有效的药物来治疗相关疾病。本课题同时对RyR相关疾病的分子机理和治疗方法进行了探索。法国合作单位在有IFV临床表型的病人中发现位于人源RyR2（心脏亚型）SPRY1结构域上的I784F点突变与IFV的发生有强烈相关性。本课题通过X射线蛋白晶体学技术解析了老鼠RyR2SPRY1-I784F突变体的高分辨率晶体结构，并结合生物物理技术，揭示了该突变对SPRY1结构域的结构、功能和热稳定性的影响，阐明了疾病突变通过影响相邻结构域之间的相互作用进而改变通道开放概率的分子机理。此外，本课题还提出针对双酰胺结合位点设计药物治疗RyR相关疾病的新思路，并在两个CCD模型上证实了治疗方法的潜在可行性。针对CCD突变型兔子RyR1（骨骼肌亚型）为靶点进行双酰胺衍生物的高通量筛选，成功获得了14个有潜在治疗效果的候选化合物分子。 综上所述，本课题为基于RyR靶标的杀虫剂和药物设计开发提供了准确的结构模版和重要的理论基础，具有十分深远的意义。
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