摘要
目的：中医具有多靶点、多环节、多途径的优势，具有整体治疗的理念，人参作为中药已有1000多年历史。据现有研究报道，人参的不同部位具有不同的药用价值和特性。目前对于人参的差异研究主要集中在不同种类、不同产地、不同年限、不同炮制方法以及地上与地下部分等方面，而对于人参根皮和芯的差异研究鲜有报道，并且其在体内的代谢模式差异也尚不明确。本研究旨在利用色谱技术分析人参芯与人参皮中主要皂苷成分的含量差异；利用肠道菌群探究人参芯与人参皮对小鼠肠道菌群结构的调节作用差异；基于色谱-质谱联用技术，应用非靶向代谢组学对小鼠粪便样本中菌群代谢物进行分析，结合微生物多样性，探讨服用人参芯和人参皮提取物后体内的代谢情况作用差异，为人参药材的药效研究以及在临床的合理应用提供新的思路和科学依据。 方法：1.建立人参芯与人参皮中人参皂苷的分析方法：利用高效液相色谱技术（HPLC），建立人参芯与人参皮中主要皂苷成分的定量分析方法，比较人参芯和人参皮中8种皂苷成分的含量差异。 2.人参芯与人参皮改变小鼠肠微生物结构的作用差异研究：应用Accu16STM细菌绝对定量测序检测各组粪便样品，用QIIME2软件进行α多样性分析；使用R包ade4、scatterplot3d进行PCA分析；利用LEfSe分析展示差异物种对差异贡献度大小分析；采用ANOVA分析方法，获得优势差异物种在组内的丰度及组间比较。基于门水平和属水平分析微生物群落结构的变化情况、功能注释及代谢通路情况，进而明确人参芯与人参皮对小鼠肠道菌群的调节作用差异。 3.服用人参芯与人参皮提取物后小鼠体内代谢情况的作用差异研究：基于的液质联用（LC-MS）的非靶向代谢组学研究手段，对数据进行峰面积的批次归一化（batch normalization）。使用PCA和OPLS-DA进行多元变量分析；基于VIP＞1及t检验p＜0.05筛选与服用人参根不同部位提取物后的相关潜在代谢生物标志物；使用生物学数据库HMDB，massbank，LipidMaps，mzclound和KEGG鉴定生物标志物、分析代谢通路；进而探讨服用人参芯和人参皮提取物后小鼠体内的代谢模式差异。 结果：1.人参根不同部位皂苷的提取及含量差异分析：本研究采用振摇法获得人参芯和人参皮醇提物，分别以正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取的方式进行纯化，得到提取物冻干粉末。选取8种常见的人参皂苷成分进行定量分析并进行了方法学考察，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd，结果表明人参皮中8种皂苷成分的总量是人参芯中的5.41倍。 2.人参根不同部位对小鼠肠道菌群的调节作用差异：基于门水平和属水平对对照组（Control）、人参芯组（GS-X）、人参皮组（GS-C）小鼠的肠道微生物进行分析发现，在门水平上，与对照组（Control）相比，人参芯组（GS-X）小鼠肠道中的厚壁菌门丰度显著增加，拟杆菌门和疣微菌门丰度显著下降；人参皮组（GS-C）小鼠肠道中的厚壁菌门和疣微菌门丰度显著增加，拟杆菌门丰度下降。在属水平上，与对照组（Control）相比，人参芯组（GS-X）共改变13种菌属，2种上调，11种下调；人参皮组（GS-C）共改变15种菌属，5种上调。KEGG代谢途径分析结果显示人参芯组（GS-X）和人参皮组（GS-C）肠道菌群中28个代谢类别存在显著性差异。 3.人参根不同部位对小鼠的代谢情况的作用差异：与对照组（Control）相比，共筛选出39种差异代谢物，其中人参芯组（GS-X）共显著改变17种代谢物，有4种上调，13种下调；人参皮组（GS-C）共显著改变22种代谢物，其中6种上调，16种下调。在长期给药人参芯和人参皮提取物后，小鼠粪便中显著变化的代谢物主要参与的代谢通路有氨基酸代谢、花生四烯酸代谢、胆汁酸代谢、亚油酸和脂肪酸代谢。除了共同参与的氨基酸代谢外，人参芯侧重于参与调节胆汁酸代谢，人参皮侧重于调节亚油酸和脂肪酸代谢通路。且人参芯可减少小鼠粪便中有关花生四烯酸代谢物的含量，而人参皮可上调小鼠粪便中有关花生四烯酸代谢物的含量，二者作用趋势相反。 结论：采用振摇法获得人参芯和人参皮提取物，选取8种常见的人参皂苷成分进行定量分析并进行了方法学考察。结果表明人参皮中8种皂苷成分的总量是人参芯中的5.41倍，人参芯和人参皮在皂苷含量上具有较大差异。应用Accu16STM细菌绝对定量测序检测各组小鼠粪便样品，基于门水平和属水平对对照组（Control）、人参芯组（GS-X）、人参皮组（GS-C）小鼠的肠道微生物进行分析发现，人参芯组（GS-X）和人参皮组（GS-C）给药组均能够增加有益菌属的数量，但人参芯组（GS-X）有益菌属的增加更具显著性，而长期给药人参皮提取物可能会增加致病风险。通过KEGG代谢途径分析人参芯和人参皮作用之间的区别和差异性，结果显示服用人参芯和人参皮提取物后小鼠肠道微生物代谢通路有一定的差异，因此进一步通过粪便代谢组学分析和证实人参芯和人参皮对小鼠粪便代谢物的影响差异。结果表明，相较于对照组（Control），人参皮组（GS-C）中的差异代谢物比人参芯组（GS-X）更多，参与了更多体内代谢通路。除了共同参与的氨基酸代谢外，人参芯侧重于调节胆汁酸代谢，人参皮侧重于调节亚油酸和脂肪酸代谢通路。且值得注意的是，人参芯可下调小鼠粪便中有关花生四烯酸代谢物的含量，而人参皮可上调小鼠粪便中有关花生四烯酸代谢物的含量，二者作用趋势相反。推测服用人参芯和人参皮提取物后小鼠体内代谢模式具有明显差异的主要原因可能是人参芯和人参皮中皂苷的含量和比例不同。本研究初步阐明了基于“肠道菌群-代谢物”轴，服用人参芯和人参皮提取物后体内的代谢模式差异，为人参药材的药效研究以及在临床的合理应用提供了新的思路和科学依据。
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