摘要
拟除虫菊酯类农药是目前世界上使用最广泛的杀虫剂之一，在环境中的残留和积累，给人类健康和生态系统造成了巨大的威胁。生物降解因为其高效、安全、无二次污染，已成为农药残留修复的有效措施。本研究基于细胞表面展示技术，以来源于铜绿假单胞菌GF31的拟除虫菊酯降解酶（Aps）作为目的蛋白，尝试构建大肠杆菌和酿酒酵母表面展示工程菌，对其进行工程优化并应用于环境中残留拟除虫菊酯农药的去除。 大肠杆菌具有清晰的遗传背景、简单成熟的遗传操作技术令其在表面展示系统中有着独特的优势。本研究通过筛选表达质粒、载体蛋白和宿主菌，最终获得六种具有活性的大肠杆菌表面展示工程菌，其中活性最高的是工程菌R-22b-InaKN-Aps，活性达到0.16U/OD600/mL。然后采用细胞分级分离电泳和免疫荧光分析等技术证明了融合蛋白InaKN-Aps准确定位在大肠杆菌的细胞表面，表明成功构建了拟除虫菊酯降解酶Aps的大肠杆菌表面展示工程菌。 酿酒酵母菌因其生态安全性使其能够应用于食品及环境工业。本研究通过N端和C端融合的方式，构建了两种具有活性的酿酒酵母表面展示工程菌EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps，其酶活性分别为0.25U/OD600/mL和0.12U/OD600/mL。采用Western blot、免疫荧光分析和流式细胞分选等技术证明了融合蛋白Aga2-Aps准确定位在酿酒酵母的细胞表面，表明成功构建了拟除虫菊酯降解酶Aps的酿酒酵母表面展示工程菌。 对构建的表面展示工程菌进行催化工艺优化，结果表明，三种表面展示工程菌（R-22b-InaKN-Aps、EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps）的最适反应温度为60℃，最适pH为9.0，且在最适条件下重复利用十个批次后，均能保持初始酶活性的70％以上，具有良好的可重复利用性；三种工程菌均能能降解五种常用的拟除虫菊酯农药，具有良好的底物广谱性，其中对高效氯氰菊酯的降解效果最好，降解速率分别为35.9μmol·L-1·d-1，33.16μmol·L-1·d-1和28.99μmol·L-1·d-1。进一步研究发现，工程菌EBY100-pYD1-Aga2N-Aps和EBY100-pYD1-Aga2C-Aps可作为洗涤剂去除生菜和樱桃番茄中残留的高效氯氰菊酯农药，为食品加工工业和家庭的果蔬农药残留去除提供一种新选择。 本研究利用表面展示技术，以拟除虫菊酯降解酶Aps作为目的蛋白，构建了细菌和真菌两种表面展示系统，获得三种新型的表面展示工程菌，具有比原始菌株GF31更高的降解活性。与直接利用降解酶相比，表面展示工程菌可重复使用，且价格更低廉。本研究为拟除虫菊酯类农药的原位生物修复提供理论基础，也为其它疏水性有机污染物的环境生物修复提供有益的借鉴。
NETL