摘要
甜菜不仅是我国第二大糖料作物，同时还是动物饲料以及生物乙醇生产的重要来源，因此也被称之为“能源甜菜”。如今土壤镉(Cd)污染己成为一个严峻的全球性问题，它不仅会影响植物生长，还会对人类健康造成严重危害。植物修复是一种以植物为基础、解决土壤污染的绿色技术。在修复重金属土壤污染的基础上开发能源甜菜，研究其响应Cd胁迫的机制具有重大意义。重金属相关异戊二烯化植物蛋白(Heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPP)是植物金属伴侣蛋白中的重要成员，在植物解毒和体内重金属代谢平衡中发挥着关键作用。在前期对能源甜菜镉胁迫的转录组研究中发现，BvHIPP24受镉胁迫显著诱导，猜测其可能参与能源甜菜对镉胁迫的响应。因此，本研究通过研究镉胁迫下能源甜菜生理响应，探究能源甜菜对镉胁迫的响应机制;克隆BvHIPP24基因，并对该基因进行生物信息学、转录表达调控、异源表达等分析，初探BvHIPP24基因在镉胁迫下所发挥的功能。研究的主要结果如下: (1)本试验对能源甜菜在镉胁迫下形态、生理生化和超微结构进行了研究。发现在0.5mM和1mM Cd胁迫下，甜菜幼苗的株高、干重受到一定程度的抑制，叶片逐渐萎蔫黄化，根系呈暗棕色;随着镉浓度的增加，甜菜地上部和地下部中Cd的含量总体呈增加的趋势;镉胁迫还引起了丙二醛(MDA)含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性的增加;此外，镉胁迫损害了细胞的超微结构，在0.5mM Cd胁迫下细胞核、线粒体和叶绿体均有不同程度的损伤。 (2)采用RT-PCR方法对BvHIPP24基因进行克隆，获得BvHIPP24基因的CDS全长。该基因开放阅读框为444bp，编码蛋白为147个氨基酸，含有HMA结构域和异戊二烯化基序。该基因编码蛋白的分子量为16377.34Da，为亲水性稳定蛋白，不存在跨膜结构域和信号肽。通过HMM和BLAST两种方法来鉴定得到能源甜菜基因组中共有24个BvHIPPs家族成员。对该家族氨基酸序列进行多重比对，发现它们在HMA结构域和异戊二烯化基序上存在一定的相似性。 (3)构建植物表达载体pCAMBIA1300-BvHIPP24-GFP，农杆菌注射烟草，对BvHIPP24融合蛋白进行亚细胞定位观察，发现BvHIPP24定位于细胞核和质膜。这种双重定位对于BvHIPP24参与镉离子转运和区隔至关重要。 (4)利用半定量PCR和qPCR对能源甜菜在镉胁迫下的表达模式进行分析发现，BvHIPP24在根中的表达量要高于叶片;在0.1、0.5和1mM Cd胁迫下，BvHIPP24基因表达量在叶和根中均表现出上调趋势，表明BvHIPP24基因受镉胁迫诱导调控。 (5)构建酵母表达载体pYES2-BvHIPP24并转化酵母INVSc1中。比较重组酵母与对照酵母在0.5mM Cd胁迫下的生长状态，发现异源表达BvHIPP24的酵母的生长状态远远优于对照菌，表现出较强的耐镉性。 本研究初步探索了能源甜菜在表型、生理生化、亚细胞结构以及BvHIPP24基因对镉胁迫的应答特点，为进一步了解能源甜菜的解毒机制以及BvHIPP24参与能源甜菜镉胁迫的调控机理奠定基础。
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