摘要
目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是全球第六大常见恶性肿瘤和第三大肿瘤相关死因。目前在肝癌的治疗中，根治性手术切除和肝移植是最佳的治疗方式。然而由于肝癌早期缺乏典型症状和体征，约60％患者被确诊为肝癌时己处于中晚期，错失最佳手术时机。因此，分子靶向治疗、经导管肝动脉化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)以及化疗等方式对于改善中晚期患者生存显得尤为重要。然而，上述治疗方式在改善肝癌患者预后中作用非常有限。近年来，随着人们对肿瘤免疫的深入研究，免疫检查点抑制剂(抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，抗程序性细胞死亡蛋白配体1(PD-L1)和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)等)对晚期肝癌患者显示出良好的治疗效果，结合不同的免疫疗法或将免疫疗法与常规治疗方法相结合已经成为抗HCC的重要前沿方向。因此，探索HCC中参与调控免疫细胞浸润的关键分子及其作用机制可能为肝癌免疫治疗研究提供新的潜在靶点。DNA损伤是由于内源性或外源性因素使细胞核苷酸序列改变导致的细胞损伤，这些DNA损伤通常被细胞的损伤反应机制所识别并修复。当DNA修复途径被破坏或功能失调时，基因组的稳定性会遭到破坏，并可因此导致癌症的发生。然而目前尚缺乏肝癌中DNA损伤修复相关基因与免疫细胞浸润的相关性研究。因此，本研究通过生物信息学数据挖掘肝癌中潜在的DNA损伤修复相关基因，并探究其与免疫浸润的相关性，以期阐明肝癌免疫治疗有价值的分子标记物。 方法:在基因集富集分析(Gene set enrichment analysis，GSEA)在线数据库中获得与DNA损伤修复相关基因列表，通过与国际癌症基因组协会(International CancerGenome Consortium，ICGC)中筛选出的肝癌中差异表达的基因取交集从而得到潜在的基因RAD51。接着在肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库和基因表达图谱分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库中验证RAD51在肝癌中的表达水平并进行临床相关性分析。通过Kaplan-Meier plotter在线工具分析RAD51与总体存活期、无进展生存期、无复发生存期和疾病相关生存期的相关性。利用LinkedOmics数据库筛选出与RAD51相关的差异共表达基因，借助基因本体论(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析肝癌中RAD51可能参与的生物学功能和信号通路。利用肿瘤免疫评估资源数据库(Tumor Immune EstimationResource，TIMER)、GEPIA数据库和CIBERSORT数据库验证RAD51与免疫细胞浸润及免疫细胞标志物的相关性。最后通过收集的临床样本制作组织芯片进行免疫组化染色验证RAD51在肝癌中的表达差异，分析了RAD51与临床病理特征和预后的关系，并验证RAD51表达与+PD-1表达的相关性。 结果:通过数据库筛选数据，共获得三个潜在的DNA修复相关基因(RAD51，CCNO和ZWINT)，生存分析显示CCNO在肝癌中预后无差异，选择尚未通过生物信息学分析报道过的基因RAD51进行研究。多个公共数据库结果显示RAD51的表达水平在肝癌组织中远高于癌旁组织。Kaplan-Meier plotter数据库的预后生存分析显示RAD51高表达的患者总体生存期、无进展生存期、无复发生存期和疾病相关生存期均差于低表达的患者。此外，通过TCGA数据库的数据进行临床因素相关性分析，结果显示RAD51的表达水平与肝癌患者临床分期、肿瘤原发灶分期(T分期)、病理分化程度(G分级)和年龄有关。TCGA数据库中的单因素和多因素分析显示RAD51是肝癌患者的独立预后因素。GO和KEGG富集分析提示RAD51的表达水平可能与神经活性配体一受体相互作用、细胞周期、DNA复制、同源重组、卵母细胞减数分裂和范可尼贫血途径有关。TIMER、GEPIA和CIBERSORT数据库分析显示RAD51的表达与肝癌中免疫细胞浸润(B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)存在密切关系，并与单核细胞、T细胞(常规)、调节性T细胞和耗竭T细胞的表面标志物表达密切相关。组织芯片分析进一步证实RAD51在肝癌患者中表达水平显著高于相应癌旁组织，是肝癌总体生存率和累计复发率的独立风险因素，并证明RAD51表达水平与PD-1呈正相关。 结论:1.RAD51在肝癌组织中表达水平显著高于癌旁组织。 2.RAD51的表达水平与肝癌患者临床分期、肿瘤原发灶分期(T分期)、病理分化程度(G分级)和年龄相关，是肝癌患者生存和复发的独立危险因素。 3.RAD51的表达与肝癌免疫细胞浸润密切相关，与肝癌中PD-1的表达呈正相关，有望成为肝癌免疫治疗潜在的新靶点。
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