摘要
产肉量影响着羊肉的供应，如何提高产肉量是遗传育种首要关注点。肌细胞的增殖、分化以及后期单核肌细胞相融合形成多核肌管是骨骼肌生长发育的基础，解析湖羊肌细胞发育的分子调控机制有望提高肉产量。研究表明，骨骼肌的生长发育需要一系列调控因素，miRNA是一种长度约为22nt的非编码RNA，可以靶向调控mRNA的表达，在肌肉细胞的生长发育中起重要作用。miR-22-3p是调控湖羊骨骼肌发育的一个重要候选分子。本研究围绕miR-22-3p对基因的表达调控作用开展，初步揭示了miR-22-3p/IGFBP3/GNAI2通路对湖羊骨骼肌原代细胞增殖和分化的调控作用，为湖羊分子育种提供数据支撑。 主要研究结果如下: (1)miR-22-3p对湖羊骨骼肌细胞增殖分化的影响 在湖羊骨骼肌细胞中转染miR-22-3p模拟物和抑制物，通过RT-qPCR、CCK-8、EdU和细胞周期实验，发现转染模拟物实验组增殖标记基因PCNA、CDK2、Cyclin D1的表达量、骨骼肌细胞活力、EdU阳性细胞数与细胞周期中的S期极显著低于对照组(P＜0.01);转染抑制物后增殖基因PCNA、CDK2、Cyclin D1的表达量、骨骼肌细胞活力、EdU阳性细胞数与细胞周期中的S期极显著高于对照组(P＜0.01);RT-qPCR和免疫荧光结果显示过表达miR-22-3p后，细胞分化标记基因MyOD、MyOG表达量极显著增加(P＜0.01)，免疫荧光MyH3阳性肌管数增多;而抑制miR-22-3p表达后，细胞分化标记基因MyOD，MyOG表达量极显著降低(P＜0.01)，免疫荧光MyH3阳性肌管数减少。以上结果表明，miR-22-3p抑制湖羊骨骼肌细胞增殖，并且促进分化。 (2)miR-22-3p靶向IGFBP3调控湖羊骨骼肌细胞增殖分化 通过mirDIP、miRTargets和RNAhybrid在线生物信息学分析软件预测IGFBP3是miR-22-3p的一个候选靶点。双荧光素酶报告系统检测表明:与对照组相比，转染miR-22-3p模拟物显著降低了荧光活性(P＜0.05)。IGFBP3属于RNA结合蛋白，具有提高RNA稳定性的作用，且该基因在湖羊骨骼肌细胞中高表达。过表达IGFBP3，细胞增殖标记基因PCNA、CDK2、Cyclin D1的mRNA水平极显著高于对照组(P＜0.01)，细胞活力显著或极显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，EdU阳性细胞数与细胞周期中的S期极显著高于对照组(P＜0.01);干扰IGFBP3后，细胞增殖标记基因PCNA、CDK2、Cyclin D1的mRNA水平显著或极显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，细胞活力显著或极显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，EdU阳性细胞数与细胞周期中的S期极显著低于对照组(P＜0.01);增殖蛋白CDK2显著低于对照组(P＜0.05);RT-qPCR和免疫荧光结果显示过表达IGFBP3后细胞分化标记基因MyOD、MyOG显著或极显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，免疫荧光MyH3阳性肌管数减少;而抑制IGFBP3表达，细胞分化标记基因MyOD、MyOG表达量极显著升高(P＜0.01)，免疫荧光MyH3阳性肌管数增多。以上结果表明miR-22-3p可以靶向IGFBP3，且IGFBP3能够促进湖羊骨骼肌细胞增殖，抑制分化。 (3)IGFBP3下游基因GNAI2对湖羊骨骼肌细胞增殖分化的影响 利用RNAct(蛋白与mRNA互作数据库)在线软件预测GNAI2是IGFBP3下游基因，并开展RIP实验直接靶向验证。转染IGFBP3干扰片段后，GNAI2基因表达极显著下降(P＜0.01);干扰GNAI2基因，细胞增殖标记基因PCNA、CDK2的mRNA水平极显著低于对照组(P＜0.01)，细胞活力极显著低于对照组(P＜0.01)，EdU阳性细胞数目极显著低于对照组(P＜0.01)。干扰GNAI2基因表达后，细胞分化标记基因MyOD、MyOG表达量显著升高(P＜0.05)，MyH3阳性肌管数增多。以上结果表明GNAI2能够促进湖羊骨骼肌细胞增殖，抑制分化。 综上，本研究揭示的miR-22-3p/IGFBP3/GNAI2通路可在湖羊骨骼肌原代细胞中发挥重要的调控作用。
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