摘要
MYB基因是植物中最大的转录因子家族之一，在植物的生长发育，在细胞形态建成、器官分化、次生代谢以及抗逆胁迫等方面发挥重要作用。中国野生葡萄——‘燕山’葡萄（Vitis yeshanensis‘Yan Shan’）具有极强的抗旱性，但MYB基因在燕山葡萄抗逆过程中的作用还不清楚。本研究以‘燕山’葡萄为材料，克隆获得VyMYB24基因，利用土壤农杆菌介导的叶盘法遗传转化烟草——本氏烟（Nicotiana benthamiana）获得稳定遗传的转基因烟草（OE1、OE3），对其在植物生长发育及干旱胁迫中的功能进行研究，主要研究结果如下： (1)VyMYB24基因（Uniprot数据库登录号：VIT_14s0066g01090）cDNA全长570bp，编码190个氨基酸，分子量为21.569kD，定位于基因组Chr14染色体；VyMYB24包含一个高度保守的R2-R3型DNA结构域，属典型的R2R3型MYB转录因子；亚细胞定位发现，VyMYB24是一个核蛋白；VyMYB24基因逆境胁迫下的表达分析发现，该基因受到干旱、高温、盐胁迫的诱导，其中干旱胁迫最为强烈。 (2)利用土壤农杆菌介导的叶盘法将VyMYB24转入本氏烟草并获得稳定遗传转基因烟草植株（OE1、OE3）。对转基因植株相关生长发育指标进行测定，发现VyMYB24基因过表达导致转基因烟草植株矮化，在生长各个时期的表型均小于野生型，具体表现为植株矮化、节间缩短、生殖器官形状变小以及叶面积变小、叶色变深等表观特征，这些结果表明VyMYB24基因参与调控烟草植株的形态发育。 (3)通过对烟草内源赤霉素GA1+3含量进行测定发现，转基因烟草植株GA1+3含量显著低于野生型烟草植株（Plt;0.05），分别为野生型烟草的47.72%和46.17%；赤霉素合成及代谢相关基因表达分析发现，发现赤霉素合成相关GA20ox类和GA3ox类基因，在转基因烟草植株（OE1、OE3）中的表达量均低于野生型烟草植株，而赤霉素降解相关基因GA2ox类基因，除了GA2ox1基因和GA2ox3基因外，其他基因在转基因烟草植株（OE1、OE3）中的表达量均高于野生型烟草植株。表明VyMYB24可能通过下调赤霉素合成相关基因和上调赤霉素降解基因，来减少转基因植株内源赤霉素含量。此外，喷施外源赤霉素GA3后，结果发现VyMYB24转基因烟草植株（OE1、OE3）矮化表型得到一定程度的恢复，株高差异缩小。说明VyMYB24基因调控赤霉素途径影响烟草植株的株高。 (4)干旱胁迫下，VyMYB24转基因烟草植株（OE1、OE3）萎焉率分别为26.67%和30.00%，而野生型烟草植株的萎焉率则达到了80.00%，转基因烟草植株的萎蔫率显著低于野生型烟草植株（Plt;0.05）；同时根鲜重显著高于野生型烟草（plt;0.05）。这些结果表明在干旱胁迫下，VyMYB24基因可以增强烟草植株的抗旱性。 (5)干旱胁迫下，转基因烟草和野生型烟草叶片过氧化氢（H2O2）含量和超氧阴离子（O2?）?产生速率均有所上升，但转基因烟草与野生型烟草相比，积累的H2O2含量和O2??产生速率显著较少（plt;0.05），H2O2含量仅为野生型烟草的64.93%和72.57%，O2??产生速率仅为野生型烟草的67.38%和66.20%；同时二氨基联苯胺（DAB）和硝基蓝四唑（NBT）染色得到相同的结果。这些结果表明在干旱胁迫下，VyMYB24基因可以通过减少烟草植株叶片组织中活性氧的积累，增强烟草植株的抗旱性。 (6)干旱胁迫下，VyMYB24基因可以显著提高转基因烟草植株（OE1、OE3）的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性及脯氨酸含量（plt;0.05），显著降低转基因烟草（OE1、OE3）植株丙二醛含量和相对电导率（plt;0.05），SOD酶活性达到了野生型烟草植株的1.91倍和1.70倍；POD酶活性达到了野生型烟草植株的1.40倍和1.32倍；CAT酶活性达到了野生型烟草植株的1.84倍和1.68倍；脯氨酸（Pro）含量达到了野生型烟草植株的176.09%和213.95%；丙二醛(MDA)含量分别为野生型烟草植株的49.07%和51.07%；相对电导率分别为0.38%和0.42%，而野生型烟草植株的相对电导率则达到了0.73%。这些结果表明在干旱胁迫下，VyMYB24基因可以通过上调抗氧化酶活性和脯氨酸含量，下调丙二醛含量和相对电导率，增强烟草植株的抗旱性。 (7)干旱胁迫下，转基因烟草植株（OE1、OE3）抗旱相关的NtERD10C、NtERD10D、NtLEA、NtSOD、NtPOD、NtCAT、NtP5CS、NtP5CR基因表达量均上调，且显著高于野生型烟草（plt;0.05）。结果表明在干旱胁迫下VyMYB24基因可以提高烟草抗旱相关基因的表达，增强烟草植株的抗旱性。
NETL