摘要
目的： 2型糖尿病（type2diabetes mellitus T2DM）是由于体内胰岛素抵抗或胰岛β细胞分泌胰岛素下降引起的以血糖升高为特征的代谢紊乱，高血糖所引起的大血管及微血管等慢性并发症已经严重影响了人类的健康。目前研究认为遗传因素、环境因素及生活方式均与T2DM的发生发展有密切关系，但这些因素是如何作用的尚无定论。近年来研究表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为调控分子在众多疾病如肿瘤、阿尔茨海默病、糖尿病等的发生发展中发挥重要的作用。相对于肿瘤，目前针对lncRNA在T2DM发生发展中的作用研究相对偏少。 应用基因芯片筛选与研究T2DM与健康对照组外周血白细胞中差异表达的lncRNA及mRNA，获得两组之间lncRNA差异表达谱，并在临床样本中进一步验证。研究其与T2DM相关临床代谢指标的相关性，探讨其对胰岛β细胞凋亡、胰岛素分泌及常见糖尿病信号通路的调控。为研究lncRNA在T2DM发病中的调控作用提供一定的思路和基础。 方法： 1.基因芯片检测：基因芯片检测获得T2DM及健康对照组外周血白细胞中lncRNA和mRNA差异表达谱，运用GO（Gene Ontology）和KEGG Pathway（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析lncRNA差异共表达的mRNA可能参与的生物学过程、细胞组分、分子功能及信号通路。 2.临床样本验证：选择差异表达较明显的lncRNA，采用实时荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR），在新诊断的T2DM患者和健康对照组中进一步验证，结果显示lncRNA HIST1H2AG-6和lncRNA AIM1-3在外周血白细胞的表达与基因芯片表达一致。以lncRNA HIST1H2AG-6和lncRNA AIM1-3为研究对象，应用qRT-PCR检测其在T2DM患者及对照组外周血白细胞中表达水平。分析二者表达水平与糖尿病代谢指标的相关性。采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve,ROC）及多元回归分析lncRNA HIST1H2AG-6与lncRNA AIM1-3异常表达在T2DM诊断中的临床价值。 3.LncRNA HIST1H2AG-6对胰岛β细胞亡、胰岛素分泌以及糖尿病相关信号通路的影响：应用生物信息学软件分析与lncRNA HIST1H2AG-6、lncRNA AIM1-3相关差异表达mRNA，构建lncRNA-mRNA互作网络。并探索其潜在富集信号通路和生物学过程。构建LncRNA HIST1H2AG-6过表达质粒，转染小鼠胰岛素瘤细胞株MIN6细胞。流式细胞技术及CCK-8（Cell Counting Kit-8）分析转染lncRNA HIST1H2AG-6过表达对MIN6细胞凋亡、增殖的影响。酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测过表达lncRNA HIST1H2AG-6后，MIN6细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌（Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS）的反应。同时应用qRT-PCR，Westernblot技术检测lncRNA HIST1H2AG-6对MIN6细胞胰岛素转录调节因子MaFa、PDX-1、FOXO1以及GLUT-2在核酸及蛋白质水平的表达。构建过表达lncRNA HIST1H2AG-6的慢病毒载体，感染小鼠胰岛β细胞。流式细胞技术检测lncRNA HIST1H2AG-6过表达对小鼠胰岛β细胞凋亡、增殖的影响。ELISA检测过表达lncRNA HIST1H2AG-6后，小鼠胰岛β细胞对GSIS的反应。同时应用qRT-PCR，Westernblot检测过表达lncRNA HIST1H2AG-6对胰岛β细胞中胰岛素转录调节因子MaFa、PDX-1、FOXO1以及GLUT-2在核酸及蛋白质水平的表达。过表达lncRNAHIST1H2AG-6质粒转染MIN6细胞，Westernblot分别测定PKA、p-PKA、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、P38、p-P38水平。发现lncRNA HIST1H2AG-6抑制PKA和JNK的磷酸化产物p-PKA，p-JNK的表达水平。给予cAMP/PKA激动剂Forksin和JNK激动剂Anisomycin后，流式细胞技术检测MIN6细胞的凋亡、ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌、Westernblot检测胰岛素转录调节因子MaFa、PDX-1以及GLUT-2的表达。 结果： 1.基因芯片分析T2DM组和正常对照组的外周血白细胞中lncRNA表达谱的改变，筛选出差异表达lncRNA共55个，mRNA共36个（fold change≥2且Plt;0.05）。GO分析结果显示最高富集的GO靶标与细胞程序性凋亡、细胞对机械刺激的反应、细胞膜的去极化、磷酸化过程及胰岛素受体信号通路的负调控等有关；KEGG Pathway分析显示lncRNA相关mRNA参与的信号通路主要富集在淀粉及蔗糖类物质代谢通路、肿瘤相关信号通路及NOD样受体信号通路等。 2.在临床样本进行qRT-PCR验证，结果显示lncRNA HIST1H2AG-6在T2DM组表达升高（P=0.002），lncRNA AIM1-3在T2DM组表达降低（P＜0.001），这一结果与基因芯片检测的表达相一致。分析lncRNA HIST1H2AG-6与lncRNA AIM1-3的差异表达与糖尿病各临床代谢指标的关系。 (1)相关性分析发现lncRNA HIST1H2AG-6水平与低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、血尿酸（UA）呈正相关（P=0.026，P=0.021），与β细胞稳态模型（HOMA-β）负相关（P=0.039）；lncRNA AIM1-3与空腹胰岛素（FIN）（P=0.003），HOMA-β（Plt;0.001），HDL-C（Plt;0.001）呈正相关，与空腹血糖（FPG），糖化血红蛋白（HbA1c）呈负相关（P均lt;0.001）。 (2)多元回归分析发现体重指数（BMI）、LDL-C、高密脂蛋白胆固醇（HDL-C）、lncRNA HIST1H2AG-6、lncRNA AIM1-3等5个变量与T2DM显著相关。其中lncRNA AIM1-3表达与T2DM呈负相关（β=-2.54，OR=0.071，95%CI0.029~0.178，Plt;0.001），lncRNA HIST1H2AG-6表达与T2DM呈正相关（β=1.756，OR=5.791，95%CI2.275~14.739，Plt;0.001）。 (3)ROC曲线分析显示lncRNA HIST1H2AG-6的ROC曲线下面积（AUC）为0.664（95%CI0.549~0.780，P=0.007），lncRNA AIM1-3的AUC为0.769（95%CI0.662~0.875，Plt;0.001）。 3.针对lncRNA HIST1H2AG-6与lncRNA AIM1-3共表达mRNA的分析显示相关mRNA主要参与到包括淀粉和蔗糖代谢通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路等，在包括细胞代谢过程、免疫应答和信号转导等GO通路富集。其中淀粉和蔗糖代谢、MAPK信号通路与T2DM发病密切相关。 4.LncRNA HIST1H2AG-6过表达对MIN6细胞的调控作用 (1)在MIN6细胞转染过表达lncRNA HIST1H2AG-6质粒与对照组相比，lncRNA HIST1H2AG-6过表达会促进MIN6细胞凋亡（Plt;0.05），增殖能力下降（Plt;0.001）。 (2)Westernblot结果显示caspase3蛋白（促凋亡）表达上调，而Bcl-2蛋白（抗凋亡）表达下调。 (3)GSIS试验中，葡萄糖浓度升高（22.2M，33.3M）刺激MIN6细胞胰岛素分泌，而过表达lncRNA HIST1H2AG-6使MIN6细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力下降。 (4)过表达lncRNA HIST1H2AG-6引起PDX-1及GLUT-2在核酸及蛋白质水平表达均下降。 结论： 1.利用高通量基因芯片技术分析筛选获得了T2DM患者和健康对照组外周血白细胞中lncRNA和mRNA的差异表达谱，有助于从长链非编码基因的角度更好了解T2DM的发病机制。 2.对lncRNA共表达的差异mRNA进行GO和KEGG Pathway分析，为推断T2DM相关lncRNA的生物学功能及潜在参与调控的信号通路奠定相关理论基础。 3.筛选获得了差异表达的两个长链非编码RNA HIST1H2AG-6和AIM1-3，均与T2DM密切相关，对T2DM具有一定的诊断价值。 4.LncRNA HIST1H2AG-6可能通过促进胰岛β细胞的凋亡，下调MaFa、PDX-1及GLUT-2的表达，负向调节GSIS而参与葡萄糖代谢的调控；这些效应可能是通过抑制JNK及cAMP/PKA信号通路实现的。
NETL