摘要
近年来失眠发病率的提高以及长期失眠对患者产生的不良影响已经使失眠的治疗研究成为当代医学的热点。根据多年临床经验，镇江市中医院脑病科陆素琴院长在桂枝汤、小柴胡汤和甘麦大枣汤的基础上总结得出柴桂枣安汤这一复方，并且在临床上已经证实其对肝胆气滞型的失眠治疗具有明显的作用。本研究对柴桂枣安汤治疗失眠的药效进行再次验证，并对柴桂枣安汤抗失眠的机制进行探索。 目的： 对柴桂枣安汤防治失眠的疗效加以了检验，并从中医复方研究的整体性入手，通过网络药理学的方式探究了柴桂枣安汤各中药的活性成分，作用靶点及信号通路；利用蛋白质组学技术分析柴桂枣安汤作用于失眠大鼠模型后海马组织中差异蛋白的变化；将网络药理学结果和蛋白质组学结果进行融合，探索两部分结果中共同存在的靶点和信号通路，研究柴桂枣安汤治疗失眠的可能作用机制。 方法: 1．为建立失眠模型，对大鼠进行了PCPA腹腔注射。成功后，根据分组对药物处理组大鼠进行药物干预。通过观察记录大鼠自主活动，检测其血清中BDNF、Bcl-2、Bax、IL-2、IL-6、GFAP水平在药物处理前后的变化来验证柴桂枣安汤治疗失眠的药效。 2．采用网络药理学的技术，挖掘柴桂枣安汤中各中药的潜在活性成分，挑选出各活性成分所对应的靶点，另外，筛查疾病数据库中有关失眠的靶点，并对两者的共有靶点进行整合，筛选出的共有靶点被视为柴桂枣安汤治疗失眠的潜在靶点。将共有靶点输入到String数据库中，利用Cytoscape3.7.2软件，建立蛋白相互作用（PPI）网络，并将柴桂枣安汤作用于失眠的靶点输入DAVID数据库中，对其进行GO和KEGG分析。 3．建立失眠大鼠模型并用柴桂枣安汤进行干预，鉴定出药物处理后与失眠状态相比大鼠海马组织中的差异表达蛋白，并对这些差异蛋白进行分析。然后将利用蛋白质组学所得到的药物处理组与模型组之间的差异蛋白输入到数据库中，利用Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络，并利用其中的ClusterOne算法按照P＜0.005、Node＞6的筛选标准对PPI网络进行核心蛋白聚类分析。 4．将柴桂枣安汤抗失眠的第二部分和第三部分实验结果进行联合分析，筛选出两部分结果中共同存在的靶点。 结果： 1.模型组大鼠自主活动较正常组明显增加(P＜0.05)。与给药前相比，柴桂枣安汤高剂量组在药物干预后自主活动明显减少(P＜0.05)。与模型组比较，BDNF水平在高剂量组血清中有明显的升高(P＜0.05)，GFAP水平在两个剂量组血清中都有明显的降低(P＜0.05)，IL-2和IL-6的水平以及Bcl-2/Bax比值与模型组相比也有明显的提高(P＜0.05)。 2．网络药理分析了柴桂枣安汤包含的15种草药，共筛选出柴桂枣安汤中的非重复活性成分228个，并预测了与失眠相关的129个靶点。经网络分析显示，beta-sitosterol（β-谷甾醇）、kaempferol（山柰酚）、Allantoin（尿囊素）、Stigmasterol（甾醇）、quercetin（槲皮素）等成分作用于网络中的多个靶点。PPI网络显示，CHRM2、HTR1A、ADORA1、TNF、DRD2、DRD4可能是柴桂枣安汤作用于失眠的关键靶点。GO富集分析发现柴桂枣安汤抗失眠在分子功能（MF）上关联密切的GO术语有54个，在生物过程（BP）中，与柴桂枣安汤抗失眠关联密切的GO术语有204个，在细胞组件（CC）中，与柴桂枣安汤抗失眠关联密切的GO术语有29个。KEGG通路分析发现与柴桂枣安汤抗失眠显著相关的KEGG通路50个。 3．本实验从大鼠海马组织中检测出4773个蛋白。以差异倍数＞1.2为显著上调，差异倍数＜0.833为显著下调。经过差异蛋白分析发现，与模型组比较柴桂枣安汤组所检测到的差异蛋白中有220个表达上调，115个下调，共335个，其中Slc1a2、Orm1、Tia1、Ankrd6等蛋白差异倍数较大。通过生物信息学GO分析发现差异表达蛋白在生物过程（BP）水平上的的GO术语有133个。在细胞组件（CC）水平上的GO术语有37个。在分子功能（MF）水平上的GO术语有46个。通过KEGG分析发现与柴桂枣安汤抗失眠有关的差异蛋白所富集的通路共21条。在构建的PPI网络中，共筛选出6个核心蛋白聚类。 4．通过将网络药理学的所筛选的柴桂枣安汤抗失眠的潜在核心靶点与蛋白质组学筛选的差异上调和下调蛋白进行联合分析，结果显示柴桂枣安汤在两种方法上共同富集在9条信号通路，分别是African trypanosomiasis（非洲锥虫病）、Malaria（疟疾）、Amphetamine addiction（安非他命上瘾）、Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活动配体-受体相互作用）、Amyotrophic lateral sclerosis(ALS，肌萎缩侧索硬化症)、Serotonergic synapse（五羟色胺能突触）、Morphine addiction（吗啡上瘾）、Calcium signaling pathway（钙信号通路）、GABAergic synapse（GABA能突触）。Ca2、F2、Kcnc2、Apod、Prkcd、Map2、Gria2七个蛋白为网络药理学和蛋白质组学共同重叠的蛋白。 结论： 1．柴桂枣安汤对失眠状态下失眠大鼠的自主活动时间和站立次数都有明显的抑制作用，并且在给予柴桂枣安汤干预后，相关的血清指标与失眠状态下的水平相比也有了明显的改善。说明采用柴桂枣安汤治疗失眠药效显著。 2．柴桂枣安汤作用于失眠的机制可能涉及9条信号通路和Ca2、F2、Kcnc2、Apod、Prkcd、Map2、Gria2七个核心靶点。
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