摘要
恶性肿瘤是一种威胁到人类生命的疾病，给社会造成非常大的负担。随着生命科学技术的发展及现代分析仪器的高精尖化，人们开始从分子水平上去探索恶性肿瘤的发病机制，发现一些基因的异常表达与一些恶性肿瘤的发病密切关联。高灵敏高特异性的核酸基因突变检测技术的发展，给恶性肿瘤的早期诊断带来很大的福音。B淋巴细胞白血病的原因之一是Pax-5a基因的异常表达，因此Pax-5a基因的检测可为B淋巴细胞白血病的早期筛查提供有效的技术手段。CRISPR/Cas技术具有快速灵敏的特点，在核酸检测方面引起了越来越多的关注。为了实现对B淋巴细胞白血病制定针对性强的治疗方案和提供精确的用药数据支持，在本研究中，基于功能性核酸探针和多酶辅助以不同思路设计了三种生物传感系统来检测白血病基因Pax-5a。三种生物传感系统的成功构建，为白血病的早期临床诊断和治疗提供了新的技术支持。 首先，为了高灵敏度检测白血病基因Pax-5a，我于Lambda核酸外切酶剪切5’磷酸化DNA的特性以及结合杂交链式反应（HCR）构建了一种生物传感器。在该传感器中，Lambda核酸外切酶切割Pax-5a基因与发夹探针结合形成的平末端，以使触发杂交链式反应的核酸序列暴露出来。H1和H2用荧光基团和猝灭基团修饰，HCR使荧光基团和猝灭基团彼此远离，从而使荧光基团的荧光信号得以恢复，实现了对Pax-5a的高灵敏检测，检测限（LOD）为7.6pM。并且，该生物传感器还可区分Pax-5a基因的碱基错配序列。 其次，为了进一步提高检测Pax-5a的灵敏度，我们基于具有回文序列的双分子发夹探针和CRISPR/Cas12a系统设计了一种生物传感系统。在该传感系统中，通过靶基因的加入，从而使发夹与靶基因组装，在聚合酶和切口酶的协同作用下实现DNA链的等温扩增，用于CRISPR/Cas12a系统的多通道收集，实现信号的放大。当靶基因浓度在1fM~50nM范围内时，荧光强度与靶基因浓度的对数呈极好的线性关系，检出下限为1fM。此外，在实际样品分析中仍能保持良好的检测性能，并且可区分靶标的错配序列。 最后，基于上个工作中CRISPR/Cas12a系统检测目标的优异特性，在本工作中利用双酶辅助靶基因循环以及CRISPR/Cas12a蛋白酶的无序切割功能构建了高效检测Pax-5a基因的传感系统。在系统中，巧妙设计了一种糅合了靶基因与引物的结合位点以及一半的Nt.BbvCI剪接位点的发夹探针。当目标基因存在时，通过KF和Nt.BbvCI的协同作用，可以产生大量特定序列的单链，同时实现目标基因的循环。产生的DNA单链可激活CRISPR/Cas12a蛋白酶的切割活性。从而使标记有荧光基团（FAM）和猝灭基团（BHQ）的单链被裂解，产生可检测的荧光信号，检测限低至6.77fM。
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