摘要
鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine transcarbamylase，OTC；EC2.1.3.3)是一种以氨基甲酰磷酸、L-鸟氨酸为底物，催化氨甲酰基团转移至鸟氨酸生成L-瓜氨酸的蛋白酶。该酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是新陈代谢不可或缺的酶，因此研究鸟氨酸氨甲酰基转移酶的结构、功能以及催化特性具有十分重要的意义。本研究以钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum MT）基因组为模板，克隆C.crenatum OTC的编码基因argF的开放阅读框，构建基因表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）以表达重组蛋白，并通过亲和层析进行纯化；在此基础上分析了C.crenatum OTC的基本酶学性质并通过生物信息学以及定点突变对酶的活性中心、功能结构进行了研究。本实验的主要研究结果如下： 1.C.crenatum OTC编码基因argF的克隆、诱导表达及鉴定：通过PCR技术克隆argF开放阅读框，并连接至表达载体pXMJ19，转化至BL21进行表达，结果表明37℃，经0.7mM IPTG诱导培养8小时可获得最高表达量的具有生物活性的可溶性蛋白；SDS-PAGE分析发现，获得的重组蛋白分子量约为37kDa。 2.C.crenatum OTC的酶学性质：酶活性测定实验表明，C.crenatum OTC的酶促反应最适pH为9.0左右，最适温度在35℃左右，Cu2+对该酶活力有抑制效应；动力学参数Kmcp为4.71mM、Kmorn为0.28mM、Kcat为4.13S-1、Vmax为7.21μmol?min-1?mg-1。 3.C.crenatum OTC关键氨基酸残基的鉴定：通过SWISS-MODEL预测OTC蛋白酶的活性中心，对处于该活性中心的氨基酸进行突变，构建丙氨酸扫描文库，鉴定出了对酶活性起重要作用的氨基酸残基位点：R57A、N171A、D234A、L275A和R302A，这些氨基酸残基的突变导致酶的比活力降低90%及以上。对酶活力回复突变体分析发现，这几个氨基酸残基位点维系着酶活性中心与底物之间的氢键作用力，并对酶活性中心的电荷环境有着一定的影响。其次，确定了两个处于酶活性中心入口处的氨基酸残基位点Pro276和Tyr278，P276维持着酶活性中心的疏水性环境，它的突变会导致酶的比活力下降90%；Y278突变为丙氨酸则可以扩大底物进出酶活性中心的路径，使得酶的比活力上升8.5%。同时，本研究找到了在其它物种OTC中保守的氨基酸残基位点，但在钝齿棒杆菌OTC中不保守的两个位点，Asp52和Ile232，它们都是处于离酶活性中心8?的位点，然而将其突变为保守氨基酸残基后导致酶的比活力分别下降80%、60%。 4.C.crenatum OTC模拟持续性乙酰化修饰突变对其活性的影响：通过质谱分析发现C.crenatum敲除去乙酰化酶的编码基因cobB后，OTC增加了乙酰化修饰位点Lys294。对质谱显示的乙酰化修饰位点Lys30、Lys281、Lys294进行模拟乙酰化修饰突变，发现以上蛋白突变体酶活性都有不同程度的降低。测定了WT和突变体K294Q对底物L-鸟氨酸的Km分别为0.28mM和0.31mM；相比于WT，K294Q与底物L-鸟氨酸的亲和力有所下降，导致酶活力的降低。
NETL