摘要
人们滥用和误用抗生素的现象导致病原微生物的种类和数量持续增加，抗生素耐药性已经成为全球公共卫生问题的主要威胁之一。因此，寻找人类可以很好耐受的有效抗菌治疗方法和药物迫在眉睫。抗菌肽是一种具有广谱、高效抗生物活性的小分子肽，它们具有无细胞毒性、无溶血性、且无细菌耐药性的特点。本文将胡蜂毒液作为研发抗菌肽的生物模板，利用分子生物学技术提取胡蜂毒液RNA并反转录成cDNA，利用cDNA克隆法筛选新的胡蜂蜂毒肽;所获得新型胡蜂蜂毒肽首先利用生物信息学对其生物活性进行初步预测，通过最小抑菌浓度法(MIC)、清除DPPH能力测定、溶血性实验以及抑制正常细胞增殖实验检测其抗菌活性、抗氧化活性、溶血活性和细胞毒性。通过PI染色实验检测菌体细胞膜的通透性，通过凝胶阻滞实验(EMSA)检测菌体胞膜内部的核酸等物质发生泄漏。通过探究新型胡蜂蜂毒肽的潜在抗菌作用机制，预测五种胡蜂蜂毒肽是直接杀死细菌细胞。主要研究结果如下: (1)从黑尾胡蜂(Vespaducalis)筛选出三种新型胡蜂蜂毒肽:U-VVTX-Vm1a、U-VVTX-Vm1b和U-VVTX-Vm1c）;从红娘胡蜂(Vespamandarinia)中筛选出一种新型胡蜂蜂毒肽:U-VVTX-Vm1d;从黄腰胡蜂(Vespaaffinis)中筛选出一种新型胡蜂蜂毒肽:U-VVTX-VM1e。 (2)本文所筛选的五种新型胡蜂蜂毒肽与传统抗菌肽的理化性质和三维结构进行比对可以发现:均属于稳定蛋白序列，且蛋白序列具有两亲性的特征，带有三个正电荷;五种新型胡蜂蜂毒肽与传统抗菌肽的三维结构均为α-螺旋结构。由于五种新型胡蜂蜂毒肽的理化性质与传统抗菌肽的相似，因此我们初步预测其具有抗菌特性。 (3)U-VVTX-Vm1b在16μg/mL的较低浓度均能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922的增殖，且在64μg/mL能够抑制真菌白色念珠菌CA10231的增殖;在浓度为32μg/mL的用药量时，U-VVTX-Vm1e能够抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922的增殖，且在256μg/mL能够抑制真菌白色念珠菌CA10231的增殖。U-VVTX-Vm1a、U-VVTX-Vm1c和U-VVTX-Vm1d也在不同浓度对不同菌种的增殖产生抑制作用;但五种胡蜂蜂毒肽均未对铜绿假单胞菌CGMCC1.10712产生抑制效果。 (4)五种胡蜂蜂毒肽均未表现出抗氧化活性、溶血性和细胞毒性。 (5)U-VVTX-Vm1b能够增加大肠杆菌ATCC25922细胞膜的渗透性并能够降解菌体胞内核酸等物质从而直接杀死细菌。
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