摘要
卵泡是卵巢的功能单位，在由细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)分子、平滑肌细胞、成纤维细胞等各种物质组成的卵巢基质中发育。胶原蛋白作为卵巢细胞外基质的主要成分，在卵巢生长和卵泡发育中起着重要作用。肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)作为转化生长因子β(TransformingGrowthFactor-β，TGF-β)超家族成员之一可以是骨骼肌高度保守的负调控因子，研究表明MSTN基因除了控制肌肉纤维的大小、类型和收缩性外，调节胶原蛋白的积累。然而，现有研究中MSTN基因对卵巢胶原蛋白含量的影响尚未可见。因此，本文将通过以下试验将阐明在MSNT基因缺失猪卵巢中胶原蛋白含量变化，为哺乳动物卵巢系统生物学提供新的见解。 试验1，在MSTN基因缺失母猪卵巢通过羟脯氨酸检测，利用天狼星红染色检测法检测相同年龄的野生型猪和MSTN基因缺失猪的卵巢中总胶原蛋白水平，进一步检测卵巢中胶原蛋白相关基因和蛋白水平的表达;在野生型猪和MSTN基因缺失猪卵巢切片中对于COL1A1蛋白进行免疫荧光染色，观察卵巢皮质和卵泡中COL1A1的表达情况;收集野生型猪和MSTN基因缺失猪的卵丘细胞检测胶原蛋白相关基因和蛋白水平的表达。 试验2，构建靶向MSTN基因的小干扰RNA，降低卵丘细胞中MSTN基因和蛋白表达后，采用QRT-PCR，Westernblotting等分子生物学技术，检测胶原蛋白相关基因和蛋白水平的表达。主要研究结果如下: 1.MSTN基因缺失猪的卵巢中总胶原蛋白含量显著低于同年龄野生型猪(200.3±1.5μg/gvs161.93±3.1μg/g，P＜0.05)，且MSTN-/组大卵泡数量显著减少，中、小腔卵泡数量显著增加。 2.MSTN基因缺失猪的卵巢中胶原蛋白相关基因COL1A1和COL3A1表达量显著低于同年龄野生型猪（P＜0.01），胶原蛋白相关蛋白COL1A1蛋白表达下调（P＜0.01），COL3A1蛋白表达无差异(P＞0.05)。MSTN基因缺失猪与野生型猪比较，COL1A1蛋白在卵巢皮质和卵泡免疫荧光强度明显减弱。 3.MSTN基因缺失猪的卵丘细胞中胶原蛋白相关基因COL1A1和COL3A1表达量显著低于同年龄野生型猪(P＜0.01)，胶原蛋白相关蛋白COL1A1蛋白表达下调(P＜0.01)，COL3A1蛋白表达无差异（P＞0.05）。 4.确定此干扰片段可以降低猪卵丘细胞中MSTN基因和蛋白表达的表达水平。MSTN基因和蛋白表达降可以显著降低COL1A1基因和蛋白的表达（P＜0.01），并抑制细胞活力以及促进细胞凋亡，BAX表达量显著升高（P＜0.05）。 综上所述，本研究通过在MSTN基因缺失猪卵巢、卵泡、卵丘细胞以及体外验证试验，利用QRT-PCR，Westernblotting、免疫荧光染色等研究手段，证明了MSTN基因缺失猪的卵巢，卵泡，卵丘细胞中Ⅰ型胶原蛋白相关基因和蛋白表达显著低于同年龄野生型猪;同时在体外培养卵丘细胞时干扰MSTN表达可以显著降低Ⅰ型胶原蛋白相关基因和蛋白含表达。本研究为MSTN在对卵巢胶原蛋白含量变化提供了新的理解，为哺乳动物卵巢系统生物学提供新的见解。
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