摘要
目的：本论文旨在筛选桦褐孔菌中抗肝癌活性部位，以活性部位为研究对象，进行活性成分的指认、分离、纯化，通过体外实验对桦褐孔菌活性成分进行生物活性研究。为进一步探究桦褐孔菌抗肝癌成分提供指导，对开发治疗肝癌的组分中药新药具有一定参考。 方法：首先采用系统溶剂法提取桦褐孔菌，通过MTT法测定各提取层对HepG2细胞增殖活性，筛选活性部位；其次基于LC-MS技术对桦褐孔菌活性部位进行活性成分分析，建立活性成分数据库。网络药理学和分子对接技术建立桦褐孔菌治疗肝癌的“药物-成分-靶点-通路”图，探究桦褐孔菌治疗肝癌靶基因与桦褐孔菌活性成分靶基因的亲和力大小；进一步分离纯化活性部位，通过核磁碳谱、氢谱鉴定单体化合物成分后进行活性验证。最后通过测定细胞能量代谢产物含有量、能量代谢相关酶活性、荧光实时定量PCR和细胞代谢组学等实验，检测桦褐孔菌三萜类活性成分对HepG2细胞相关基因表达及代谢物的影响。 结果：采用MTT法测定桦褐孔菌各提取部位对HepG2细胞增殖活性，发现给予各提取层给药后，HepG2细胞的增殖均产生抑制作用，二氯甲烷层效果最好；基于LC-MS技术对桦褐孔菌二氯甲烷层成分进行成分分析，指认出21个特征成分，建立二氯甲烷层成分数据库。基于网络药理学和分子对接探究桦褐孔菌二氯甲烷层抗肝癌作用的机制，网络药理学筛选桦褐孔菌治疗肝癌潜在作用靶点27个，共参与8条通路的调控，分子对接结果显示桦褐孔菌与4种肝癌蛋白均对接能力较好，8种化合物与EGFR蛋白亲和力最强，其次为MAPK3、ESR1、CTNNB1。从二氯甲烷层中分离纯化出5种单体，鉴定为：3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛(3β-Hydroxylanost-8,24-dien-21-aldehyde,3β-H)、桦褐孔菌醇(Inotodiol,Ino)、白桦脂醇(Betulin,Bet)、栓菌酸(Trametenolicacid,Tra)、羊毛甾醇(Lanosterol,Lan)；对5个化合物进行HepG2细胞增殖活性考察，其中以Ino、Bet、Tra效果最好；进而对这3个化合物进行细胞能量代谢的研究，给药后HepG2细胞能量代谢产物ATP、LD含量均下降，能量代谢相关酶GOD、LDH、HK、PK活力也随着化合物浓度质量增加而减少、25μg/mLIno结果最显著。荧光定量PCR法测定Ino对Bax蛋白表达增加，对Bcl-2蛋白表达抑制，且对HIF-1α、EGFR、MAPK3基因的表达均有降低作用。Ino给药组的代谢产物中酪氨酸、谷胱甘肽等含量存在较大差异，涉及机体的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢等多种生物合成等途径。 结论：本文经筛选得到了桦褐孔菌具有抗肝癌活性的主要部位为二氯甲烷层，指认出二氯甲烷层21个特征成分，建立数据库。分离纯化出3β-H、Ino、Bet、Tra、Lan5个活性成分；网络药理学预测桦褐孔菌抗肝癌的成分27个，筛选化合物8个与预测靶蛋白EGFR、ESR1、CTNNB1、MAPK3进行分子对接，结合能较强；桦褐孔菌主要活性成分Ino通过影响能量代谢产物含有量、能量代谢相关酶活力抑制肝癌细胞增殖，并涉及调控Bax/Bcl2凋亡通路及HIF-1α通路，代谢组学研究其可能涉及机体的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢等多种生物合成等途径发挥HepG2细胞增殖抑制作用。本研究为桦褐孔菌三萜类成分分离纯化提供理论基础；初步探讨了桦褐孔菌三萜类成分抗肝癌生物活性。
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