摘要
目的：通过观察黄连-吴茱萸最佳配伍（即反左金丸）对肝癌细胞增殖及凋亡作用的影响，探讨是否基于PI3K/Akt信号通路发挥体内外抗肝癌的药效学作用，并对其进行相关机制研究。 方法：1.体外观察黄连-吴茱萸不同配伍对人肝癌BEL-7402细胞活力的影响。细胞毒实验观察不同浓度的反左金丸对人肝细胞L-02活力的影响。CCK8法观察反左金丸不同浓度与时间下对肝癌细胞活力的影响；镜下观察细胞形态；Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态；流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡。2.体外采用Westernblot法检测反左金丸对BEL-7402细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3以及PI3K/Akt信号通路中PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt表达变化的影响。3.体内通过鼠源H22肝癌细胞，建立BALB/C小鼠右前肢腋下荷瘤模型。ELISA法检测荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α、AFP的表达。对移植瘤组织进行称重、计算抑瘤率；苏木精-伊红染色法检测移植瘤组织病理学形态变化；TUNEL法检测移植瘤组织细胞凋亡情况；免疫组织化学法检测移植瘤组织中PCNA、Ki67、CD31的表达；Westernblot法检测移植瘤组织PI3K/Akt信号通路及凋亡相关蛋白的表达。 结果：1.黄连-吴茱萸各配伍组对BEL-7402细胞活力均有显著的抑制作用（P＜0.001），其中反左金丸抑制效果最佳，选择作为后续实验研究。细胞毒实验结果表明反左金丸在一定范围内对正常细胞生长无影响。经不同浓度的反左金丸分别给药24h、48h、72h后，抑制BEL-7402细胞增殖的能力逐渐增强(P＜0.01)。反左金丸可改变细胞形态，降低细胞贴壁能力，促进凋亡发生，使细胞发出亮蓝色荧光。反左金丸能显著增加细胞凋亡数目（P＜0.001），能将细胞阻滞于G0/G1期，从而抑制增殖。2.Westernblot法结果表明反左金丸能够显著上调Bax表达、下调Bcl-2表达，使Bax/Bcl-2比值显著增加（P＜0.001）；显著增加Caspase-3的表达量（P＜0.001），显著降低PI3K/Akt通路中PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt的表达水平（P＜0.001）。3.反左金丸可增加H22荷瘤小鼠体重，改善自然生长状态。反左金丸可促进炎症因子IL-2、TNF-α分泌（P＜0.01），抑制AFP的分泌（P＜0.001），增强机免疫功能。反左金丸能显著抑制移植瘤生长（P＜0.001），改变其病理学形态；反左金丸可显著降低PCNA、Ki67、CD31的表达量（P＜0.001）；反左金丸能够显著增加Bax、Caspase-3表达、降低Bcl-2表达Bax/Bcl-2比值显著上升（P＜0.001）；并且能显著下调PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt的表达水平（P＜0.001）。 结论1.反左金丸体外显著抑制人肝癌细胞系BEL-7402生长，呈浓度依赖关系。2.反左金丸体内通过抑制H22移植瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡从而显著抑制移植瘤的生长。3.反左金丸抗肝癌的作用机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而调节Bcl-2家族蛋白的表达，激活线粒体凋亡途径，促进细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，激活Caspase3，最终诱导凋亡。
NETL