摘要
唐古特白刺（NitrariatangutorumBobr.）隶属于蒺藜科白刺属，主要分布于荒漠和半荒漠地区，具有强耐逆能力，对维护荒漠地区的生态系统稳定有重要作用。一氧化氮（NitricOxide，NO）参与调控植物生长发育、生物和非生物胁迫信号转导以及次生代谢产物的积累，当前对NO调控植物抵抗非生物胁迫的研究大都利用NO供体或NO清除剂，而关于植物通过调控内源NO的产生参与非生物胁迫耐受和次生代谢产物积累响应的研究较少。本论文克隆了唐古特白刺NO合成相关基因NtNR2和NtNOA1并对其表达模式进行分析，构建真核表达载体，分别将其转入Atnr2、Atnoa1拟南芥突变体和野生型拟南芥中，分析基因功能，探讨其在植物抵抗非生物胁迫和调控次生代谢产物积累中的作用，为解析唐古特白刺耐受逆境胁迫的分子机制奠定基础。主要研究结果如下： 1.基因表达特性分析显示，唐古特白刺NO合成相关基因NtNR2、NtNOA1在根、茎、叶中均有表达，NtNR2在根中表达量最高，NtNOA1在根、茎、叶中的表达量相当；NaCl、PEG、4℃、ABA和MeJA均可诱导NtNR2、NtNOA1的表达；克隆得到1872bppNtNR2和1608bppNtNOA1片段，生物信息学分析显示2个基因启动子均含有多个响应胁迫和激素的顺式作用元件；表明NtNR2和NtNOA1基因可能参与到唐古特白刺非生物胁迫响应及激素信号转导过程中。 2.基于唐古特白刺转录组数据，克隆得到NtNR2和NtNOA1基因ORF片段，长度分别为2709bp和1680bp，分别编码902和559个氨基酸；两个蛋白均无信号肽和跨膜结构域；NtNR2具有钼喋呤氧化还原酶结构域、细胞色素b5血红素结合结构域以及铁氧还蛋白还原酶型FAD结合域；NtNOA1具有循环置换型鸟嘌呤核苷酸结合结构域；NtNR2蛋白与开心果NR亲缘关系最近，与其序列同源性为82.47%，NtNOA1与芒果和开心果NOA1的亲缘关系最近，与其序列同源性分别为82.47%和80.36%。 3.构建pEarleyGate103-NtNR2真核表达载体，遗传转化拟南芥Atnr2突变体，分析突变体和互补株系在逆境胁迫下的表型和生理生化特性。结果显示，Atnr2突变体中NO产生缺陷表型以及对盐、干旱和ABA处理的敏感表型在互补株系中得到恢复，NtNR2缓解了互补株系由胁迫导致的光合抑制，且胁迫处理下互补株系的抗氧化酶活性和脯氨酸、黄酮、花青素的积累及其合成相关基因的表达水平均得到显著提升。表明NtNR2基因通过提升互补株系中NO的产生，增强了氧化平衡、渗透平衡的调节能力，促进了黄酮类次生代谢产物的积累，从而提高了互补株系对非生物胁迫的耐受性。 4.构建pEarleyGate103-NtNOA1真核表达载体，遗传转化拟南芥Atnoa1突变体及野生型，获得互补株系和超表达株系。逆境胁迫下的表型和生理生化特性分析结果显示，互补株系恢复了Atnoa1突变体中NO的产生缺陷表型和对盐、干旱胁迫的敏感性，并且NtNOA1过表达株系相较于野生型积累了更多的NO。过表达株系相较于野生型减轻了盐胁迫导致的叶绿素降解，并积累了更高水平的总黄酮和脯氨酸；而互补株系与突变体相比，抗氧化酶活性、渗透调节物以及总黄酮、花青素的积累均得到显著提升，并部分恢复了Atnoa1突变体盐和干旱胁迫引起的生长和光合抑制；且盐、干旱胁迫下NtNOA1的过表达和互补调控了转基因拟南芥胁迫响应相关基因及黄酮、花青素合成相关基因的表达水平。上述结果表明，由NtNOA1的过表达及互补介导的转基因株系中NO的产生，缓解了转基因植物所遭受的氧化胁迫和渗透胁迫，从而提高了植物的抗逆性。
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