摘要
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生长和发育的负调控因子。目前在狗、羊、牛等动物中都发现了MSTN基因突变，导致肌肉肥大表型。MSTN对躯体以及四肢骨骼肌的影响已经得到了深入的研究，而食管作为一种独一无二的器官由部分骨骼肌和平滑肌组成，MSTN对食道横纹肌(esophagusstriatedmuscle,ESM)的研究尚不清楚。在生理上，猪与人的食管相似，因此是研究骨骼肌功能的一个很好的模型。本试验利用已经培育出的MSTN基因敲除(MSTN-/-)猪及其野生型(Wildtype，WT)同窝仔猪。通过组织形态学、分子生物学方法，探究MSTN基因敲除对猪ESM肌纤维横断面积和数量、肌纤维类型的分布以及肌肉相关基因、蛋白质的表达。主要试验内容及结果如下: 1、生产MSTN-/-猪和WT猪。利用实验室已经培育出的MSTN-/-公猪（杜洛克×大白×长白）与WT母猪（长白×大白）横交获得了F1代MSTN单敲除(MSTN+/-)猪。为了生产具有相同遗传背景的猪，我们将MSTN+/-猪杂交，生产出了MSTN-/-和WT猪。 2、检测MSTN-/-猪ESM的组织形态学特性。苏木精-伊红染色结果显示，MSTN-/-猪ESM肌纤维横截面积显著大于WT猪(P＜0.05）。结果表明，MSTN基因敲除同样可以使ESM肌纤维肥大。 3、检测肌纤维类型的分布。试验通过免疫荧光染色法鉴定了肌球蛋白重链Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型蛋白，其中未被染色的则是ⅡX型蛋白。结果显示MSTN-/-猪Ⅰ型肌纤维百分比极显著低于WT猪(P＜0.01)，MSTN-/-猪ⅡA型肌纤维百分比极显著高于WT猪(P＜0.01)，ⅡX型肌纤维比例无显著差异(P＞0.05)。但在MSTN-/-或WT猪的ESM中未观察到ⅡB型肌纤维。结果表明，MSTN基因敲除改变了猪ESM肌纤维类型的分布并增加了ⅡA型肌纤维的比例，并且猪ESM中的肌纤维主要由Ⅰ型、ⅡA型和ⅡX型组成。 4、比较肌肉相关因子mRNA表达水平。试验通过实时荧光定量PCR法，检测了MSTN-/-猪ESM中肌肉相关因子的表达。结果显示，MSTN-/-猪ESM中生肌调节因子(Myogenicregulatoryfactors，MRFs)家族成员(Myf5，MRF4，MyoD，MyoG)的表达量升高，肌细胞增强因子2C(Myocyteenhancerfactor2C，MEF2C)的表达量降低。其中成肌分化因子(Myogenicdifferentiationfactor，MyoD)和肌细胞生成素(Myogenin，MyoG)的mRNA水平分别比WT猪高2倍和1.5倍(P＜0.01，P＜0.05)。 5、比较MyoD、MyoG以及MHC亚型蛋白的表达水平。蛋白质印记结果表明MyoD蛋白表达量极显著升高(P＜0.01)，MyoG蛋白表达量极显著升高(P＜0.01)。MSTN-/-猪ESM中肌球蛋白重链Ⅰ型(MHC-Ⅰ)蛋白表达极显著降低(P＜0.01),肌球蛋白重链ⅡA型(MHC-ⅡA)表达显著升高(P＜0.05)。 以上结果表明,MSTN基因敲除能够导致食道横纹肌肌纤维肥大并改变食道横纹肌肌纤维类型的分布，提高ⅡA型肌纤维的比例和MHCⅡA的表达，使肌纤维类型由Ⅰ型向ⅡA型发生转变。
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