摘要
以往的化学物毒性测试和风险评估主要依赖整体动物实验和“顶端终点”，不仅成本高昂、不符合“3R”原则，且与人类的相关性饱受质疑。为解决此弊端，美国国家研究咨询委员会于2007年发表了一份题为《21世纪毒性测试:愿景与策略》的研究报告，提出要基于中、高通量人源细胞（系）或细胞组分的体外试验，以及计算毒理学和系统生物学模型，建立以毒性通路为基础的测试方法，促进了将毒性通路应用于化学物风险评估的研究。毒作用模式（Modeofaction，MOA）是证据权重支持且与毒性终点相关联的一组关键事件（Keyevents，KEs）。应用MOA进行下一代风险评估，可简化对化学物毒作用机制的阐述，重点考虑与风险评估终点相关的关键毒性通路信息，并基于毒效应前期的通路改变进行外推，将毒性通路和风险评估有机联系起来。双酚A（BisphenolA，BPA）是一种典型的食品中化学污染物，以往进行的BPA的风险评估均基于传统的动物实验和“顶端终点”进行外推建立健康指导值，忽视了早期的通路改变，且存在较大不确定性。本研究基于21世纪毒性测试策略，首先使用系统综述的方法对BPA的不良健康效应进行描述，识别可能的不良效应终点；进而运用基于公共数据库的生物信息学分析和定量证据权重法建立与评估可能不良效应终点的MOA；重点选用相应的人源细胞系和高通量测试的方法验证与完善BPA的生殖毒性MOA，同时进行浓度-反应关系分析。为21世纪毒性测试策略的应用提供借鉴，为基于毒性通路的下一代风险评估奠定基础，并为提出基于MOA的BPA的健康指导值提供科学依据。 第一部分：双酚A不良健康效应的系统综述 目的：在欧洲食品安全局（EuropeanFoodSafetyAuthority，EFSA）2015年风险评估报告的基础上系统描述BPA的危害，识别BPA最可能导致的不良健康效应终点，为MOA的建立奠定基础。 方法：2015年EFSA的风险评估已系统检索了2014年之前发表的英文文献，本部分对2014年之后（至2019年9月9日）发表的英文和所有未被EFSA检索的中文BPA毒性相关文献进行系统检索。检索数据库包括PubMed、WebofScience、Embase、Toxline、Scopus、中国知网和维普网。通过标题、摘要和全文阅读进行筛选。 结果：经筛选后最终纳入文献233篇。关于BPA的生殖发育毒性、神经与神经发育毒性、免疫毒性、心血管毒性、代谢效应和致癌作用的人群流行病学研究结果不一，且高水平研究数量较少。动物研究中，目前认为BPA对成年大鼠和小鼠的一般毒性NOAEL为5mg/kg.bw/d。发育期和成年期的BPA经口暴露可能会对动物生殖发育功能产生影响，也可能会对子代学习记忆能力造成影响。关于免疫毒性、心血管毒性和代谢效应的动物研究结论不一。BPA遗传毒性的可能性等级定为“不太可能”。尚无足够证据表明在BPA暴露对动物具有致癌作用，但可能会导致动物乳腺上皮和前列腺增生，导致乳腺癌和前列腺癌发生敏感性增加。 结论：发育期和成年期的BPA经口暴露可能对动物生殖发育功能、神经系统发育产生影响，并可能会引起动物乳腺增生和前列腺增生，并增加乳腺癌和前列腺癌敏感性，上述效应为BPA最可能导致的不良健康效应终点。 第二部分：基于生物信息学分析和定量证据权重法建立双酚A的毒作用模式 目的：基于第一部分所识别的BPA的效应终点，建立相应毒效应的MOA假设，并进行MOA评估。 方法：在比较毒理学基因组数据库（ComparativeToxicogenomicsDatabase，CTD）检索BPA相关文献，排除无关文献，筛选及汇总和各靶器官（即胚胎、雌性性腺、雄性性腺、神经、乳腺和前列腺）的文献信息（包括主要应答基因和主要表型等）。结合DAVID在线分析工具对不同靶器官的纳入基因（计数?2）进行通路富集分析，建立MOA假设。使用定量证据权重法对建立的MOA假设进行评估。 结果：CTD数据库检索结果表明，BPA导致胚胎、雌性性腺、雄性性腺、神经、乳腺和前列腺损伤的共同应答基因主要包括ESR1，ESR2，MAPK1，MAPK3，BCL2，CASP3，BAX，AR和AKT1，共同表型主要包括凋亡过程、细胞增殖、睾丸激素的生物合成过程和雌激素的生物合成过程。共同KEGG通路包括雌激素信号通路、癌症相关信号通路等。经定量证据权重法评估后认为，BPA雄性生殖毒性的MOA包括分子始发事件（Molecularinitiatingevent，MIE）—BPA与G蛋白偶联受体30（G-proteincoupledestrogenreceptor30，GPR30）和/或雌激素受体（Estrogenreceptor，ER）α/?结合，KE1—丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）、丝氨酸/苏氨酸激酶（Serine/threoninekinase，Akt）、蛋白激酶G（ProteinkinaseG，PKG）和蛋白激酶A（ProteinkinaseA，PKA）通路激活，KE2—睾丸细胞功能受损，KE3—睾丸功能受损，MOA得分为54。BPA发育神经毒性的MOA包括：MIE—BPA与ERα/?结合，KE1—细胞外调节蛋白激酶（Extracellularregulatedproteinkinase，ERK）通路激活，KE2—N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-asparticacidreceptor，NMDAR）激活，KE3—海马神经元功能受损，KE4—学习-记忆功能受损，MOA得分为59。关于BPA雌性生殖毒性、发育毒性和促进前列腺增生或增加前列腺癌敏感性的研究尚不足以为其建立MOA，促进乳腺增生或增加乳腺癌敏感性的MOA正在开发中。 结论：建立了BPA雄性生殖毒性和神经发育毒性的MOA：BPA可通过与GPR30和/或ER?/?结合而激活MAPK、Akt、PKG和PKA通路导致睾丸功能受损，通过与ER?/?结合而激活ERK和NMDAR通路导致学习-记忆功能受损。但两个MOA的可信度均为中等，且目前人体数据有限，与人类关联性不足。 第三部分：双酚A致人正常卵巢上皮细胞损伤的毒作用模式 目的：本研究第一部分和第二部分研究表明尚不足对BPA雌性生殖毒性建立MOA。因此，本部分基于21世纪毒性测试的策略，采用人源细胞系（人正常卵巢上皮细胞IOSE80），探究BPA致人正常卵巢上皮细胞损伤的MOA。 方法：使用生理药代动力学（Physiologicallybasedpharmacokinetic，PBPK）模型计算BPA经口摄入后到达女性性腺浓度，设置BPA染毒组，同时设0.1%的二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）为溶剂对照，10nMβ-雌二醇（17β-estradiol，E2）为阳性对照，对人正常卵巢上皮细胞IOSE80进行28天染毒，通过绝对定量转录组测序及分析识别BPA导致IOSE80细胞损伤的可能关键通路，使用qPCR验证可能关键通路的mRNA表达水平，在此基础上给予ER和ERK抑制剂，使用Westernblot验证可能关键通路的蛋白表达，使用流式细胞术进行细胞周期测定，识别BPA致人正常卵巢上皮细胞损伤的可能KEs，并使用贝叶斯基准剂量（Bayesianbenchmarkdose，BBMD）软件对可能的KEs进行浓度-反应关系分析，计算基准剂量可信限下限（Benchmarkdoeslowerconfidencelimit，BMDL）值。 结果：基于女性性腺最大浓度（Maximumconcentration，Cmax）=0.0025nM设计9个BPA浓度用于CCK-8试验，根据CCK-8试验结果设置4个BPA浓度组。绝对定量转录组测序结果表明，IOSE80细胞暴露于BPA28天后，各组差异表达基因主要富集于真核生物的核糖体合成、RNA转运、细胞周期、细胞老化、卵母细胞成熟分裂等KEGG通路，为可能关键信号通路。qPCR结果表明，与溶剂对照组相比，BPA28天暴露导致MAPK3和CDKN3的mRNA相对表达量显著升高，CDC20的mRNA相对表达量显著降低。Westernblot结果表明，磷酸化ERK和CDKN3的蛋白相对表达水平随着BPA浓度递增而升高，并可被ERK抑制剂U0126部分抑制。细胞周期测定结果表明，与阴性对照组相比，BPA28天暴露可使IOSE80细胞G0/G1期比例显著降低，S期比例显著升高。纳入BBMD分析的KEs指标包括MAPK3mRNA表达量、CDKN3mRNA表达量、G0/G1期比例和S期比例。结果发现，所有KEs的BMDL值中，MAPK3mRNA表达量的BMDL值最小，BMDL5和BMDL10分别为77.188和107.040nM。 结论：在本实验条件下，人体实际暴露水平下的BPA导致IOSE80细胞损伤的MOA可能包括：KE1—ERK通路激活，KE2—CDKN3表达增多，KE3—细胞周期紊乱（G0/G1期比例降低和S期比例升高）。 第四部分：双酚A致人正常前列腺上皮细胞损伤的毒作用模式 目的：本研究第一部分和第二部分研究表明尚不足对BPA促进前列腺增生或增加前列腺癌敏感性建立MOA。因此，本部分基于21世纪毒性测试的策略，采用人源细胞系（人正常前列腺上皮细胞RWPE-1），探究BPA致人正常前列腺上皮细胞损伤的MOA。 方法：使用PBPK模型计算到达男性性腺浓度，设置BPA浓度组，同时设0.1%的DMSO为溶剂对照，103nME2为阳性对照，对人正常前列腺上皮细胞RWPE-1进行28天染毒，通过绝对定量转录组测序及分析识别BPA导致RWPE-1细胞损伤的可能关键通路，使用qPCR验证可能关键通路的mRNA表达水平，在此基础上给予ER和GPR30抑制剂，使用Westernblot验证可能关键通路的蛋白表达，使用流式细胞术进行细胞周期测定，识别BPA致人正常前列腺上皮细胞损伤的可能KEs，并使用BBMD软件对可能的KEs进行浓度-反应关系分析，计算BMDL值。 结果：基于男性性腺Cmax=0.0019nM设计9个BPA浓度用于CCK-8试验，根据CCK-8试验结果设置5个BPA浓度组。绝对定量转录组测序结果表明，RWPE-1细胞暴露于BPA28天后，各组差异表达基因主要富集于内吞过程、细胞周期、细胞老化、MAPK、TNF等通路，为可能关键信号通路。qPCR结果表明，与溶剂对照组相比，28天BPA暴露导致MAPKAPK2、MAP2K3、JUN、FOS、CDKN1A和CCND1的mRNA表达量显著升高，TP53和CDC25C的mRNA表达量显著降低。Westernblot结果表明，磷酸化MAPKAPK2和c-fos的蛋白相对表达水平随着BPA浓度递增而升高。与阴性对照组相比，BPA28天暴露可使RWPE-1细胞G0/G1期和S期比例显著升高，G2/M期比例显著降低。纳入BBMD分析的KEs指标包括MAPKAPK2、JUN、CDKN1A、CDC25C和CCND1mRNA表达量及G0/G1、S和G2/M期比例。所得BMDL值中，G2/M期比例的BMDL值最小，BMDL5和BMDL10分别为110.580和175.862nM，CDKN1A的mRNA表达量BMDL值也较小，BMDL5和BMDL10分别为142.394和207.648nM。 结论：在本实验条件下，人体实际暴露水平下的BPA导致RWPE-1细胞损伤的MOA可能包括：KE1—MAPK通路激活，KE2—CCND1和CDKN1A表达增多、CDC25C表达减少，KE3—细胞周期紊乱（G0/G1和S期比例升高、G2/M期比例降低）。 全文总结 本研究基于21世纪毒性测试策略，首先使用系统综述的方法识别了BPA最可能导致的不良健康效应终点，然后运用生物信息学分析和定量证据权重法建立了BPA雄性生殖毒性和神经发育毒性的MOA，最后使用人源细胞系和高通量测序的方法探究了人体实际暴露水平下（PBPK模型）的BPA致人正常卵巢上皮细胞和人正常前列腺上皮细胞损伤的MOA，可为BPA的风险评估积累数据，并为化学物MOA的建立和21世纪毒性测试策略在风险评估中的应用及推广提供借鉴。
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