摘要
研究目的： 糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM），发病率高，危害性大，与糖尿病病人心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关，是糖尿病患者的主要并发症之一。尼古丁是香烟烟雾的主要活性化合物之一，作为促进DCM发病及进程的重要因素，然而其加剧糖尿病心肌病进展机制不详。因此拟开展以下研究：（1）基于生物信息学技术深度挖掘DCM相关数据库，揭示尼古丁影响DCM可能的作用靶点进而阐明其相关机制。（2）构建高糖/高脂细胞模型（糖尿病模型）进行细胞实验，探究尼古丁对心肌细胞凋亡的影响及与吸烟密切相关细胞色素酶P4501A1（cytochromeP4501A1，Cyp1a1）和尼古丁乙酰胆碱受体β4亚基（cholinergicreceptornicotinicbeta4subunit，Chrnb4）基因在尼古丁诱导心肌细胞凋亡中的作用机制。本研究旨在探讨尼古丁对DCM的影响及其作用机制，为吸烟人群中糖尿病患者的心脏损伤治疗提供新的思路。 研究方法： 本实验从生物信息学分析与细胞实验两部分进行： 1.生物信息学分析： （1）通过GEO数据库（GeneExpressionOmnibusdatabase，GEOdatabase）、Drugbank数据库和STRING数据库3大数据库和WGCNA分析（weightedgeneco-expressionnetworkanalysis，WGCNAanalysis）对DCM和尼古丁的相关基因进行分析筛选，揭示尼古丁影响DCM的潜在的hub基因。 （2）基于hub基因基因本体（GeneOntology，GO）分析和基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）分析，通过Cytoscape软件构建影响DCM的hub基因网络以及关键靶点相关通路的交互图。 （3）进一步对hub基因和疾病调控基因进行相关性分析，鉴定hub基因与免疫浸润的关系。 （4）最后构建hub基因参与的miRNA-mRNA共表达网络，预测hub基因的转录因子（Transcriptionfactors，TFs）。 （5）ROC曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROCcurve）探讨靶点与DCM发生发展的关系。 2.细胞实验： （1）在高糖高脂条件下，尼古丁对H9c2细胞凋亡的影响。 1）培养H9c2细胞,构建细胞高糖高脂模型（糖尿病模型），并使用尼古丁处理细胞后，先通过流式凋亡和CCK-8确定最适尼古丁处理浓度。 2）流式细胞术检测细胞凋亡、活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）、线粒体膜电位水平。 3）ELISA检测细胞内超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性和微量丙二醛（Malonicdialdehyde，MDA）含量。 4）荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qPCR）或蛋白质印迹法（Westernblot，WB）检测细胞中Cyp1a1、Chrnb4、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK的表达情况。 （2）Cyp1a1和Chrnb4在H9c2细胞凋亡中的作用机制 1）转染Cyp1a1或Chrnb4干扰质粒，并采用AMPK抑制剂处理H9c2细胞。 2）流式细胞术检测细胞凋亡。 3）Westernblot检测细胞中Cyp1a1、Chrnb4、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinylaspartatespecificproteinase，Caspase）-2、Caspase-3、Caspase-9、p-AMPK的表达情况。 研究结果： 1.生物信息学分析结果 （1）在筛选出630个差异基因中，2个hub基因：Chrnb4、Cyp1a1。 （2）GO分析结果显示，2个hub基因主要涉及的通路为：Fe3＋反应、维甲酸生物合成过程。KEGG分析结果显示，2个hub基因主要涉及的通路为：色氨酸代谢、卵巢类固醇生成。 （3）尼古丁通过hub基因加重DCM进程主要与免疫细胞含量显著相关。 （4）此调节过程涉及35个miRNA，2个mRNA，Cyp1a1转录因子。 （5）ROC曲线显示Chrnb4（AUC:0.707）,Cypla1（AUC:0.769）可作为DCM的诊断指标。 2.细胞实验结果 （1）根据流式细胞术检测细胞凋亡和CCK8结果选择最适尼古丁处理浓度为6μM。 （2）与空白组相比，尼古丁组、高糖/高脂模型组和尼古丁+高糖/高脂模型组心肌细胞均出现不同程度的线粒体功能障碍和氧化应激的增加，与高糖/高脂模型组相比，尼古丁+高糖高脂模型组心肌细胞线粒体功能障碍和氧化应激增加。 （3）与空白组相比，尼古丁组、高糖/高脂模型组和尼古丁+高糖/高脂模型组心肌细胞内Cyp1a1、Chrnb4、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9表达均上调，p-AMPK表达下调。与高糖/高脂模型组相比，尼古丁+高糖高脂模型组心肌细胞内Cyp1a1、Chrnb4、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9表达均显著上调，p-AMPK表达显著下调。 （4）干扰心肌细胞内Cyp1a1或Chrnb4的表达，心肌细胞凋亡率、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9的蛋白水平均显著下调，p-AMPK表达明显上调，并且逆转了AMPK抑制剂对心肌细胞凋亡率、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9的上调及p-AMPK的下调作用。 结论： 尼古丁影响糖尿病心肌损伤进程中潜在的2个hub基因分别是Cyp1a1、Chrnb4。Cyp1a1、Chrnb4参与尼古丁加剧糖尿病诱导心肌细胞凋亡，并通过抑制AMPK磷酸化，导致线粒体功能障碍，氧化应激增加，最终激活Caspase-2凋亡途径，促进糖尿病心肌病进程。
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