摘要
背景： 抗微生物药物耐药性（AntimicrobialResistance，AMR）已成为公共卫生领域的重大挑战。肺炎克雷伯杆菌（Klebsiellapneumoniae，KP）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii，AB）是我国G-杆菌中最常见的两类致病菌，属于超级细菌“ESKAPE”家族，可有效“逃离”（escape）现有抗菌药物的治疗活性，耐药形势极为严峻。其中，碳青霉烯耐药的KP（CarbapenemresistantKlebsiellapneumoniae,CRKP）检出率、致死率高，早期识别CRKP感染的危险因素并加以控制，对预防CRKP感染至关重要，但目前仍存在争议。多重耐药的AB（MultidrugresistantAcinetobacterbaumannii，MDRAB）治疗选择有限，几乎仅对多黏菌素、替加环素（Tigecycline，TGC）等抗菌药物敏感。然而，单独应用这些敏感药物治疗MDRAB感染，存在一定的局限性。具体而言，多黏菌素类抗菌药物，如多黏菌素E（Colistin，COL），单独用药时AB容易发生异质性耐药，从而导致治疗失败；TGC则血中暴露量不足，即使是对于敏感菌株所致血流感染也疗效欠佳，而肺部、腹腔等各种原发部位感染严重时往往会继发血流感染，这使得TGC的临床应用受到极大限制。联合用药可在一定程度上解决上述问题，一方面可降低AB发生COL异质性耐药的风险，另一方面可显著增强抗菌活性，使TGC治疗MDRAB血流感染成为可能。因此，本研究以CRKP和MDRAB为研究对象，一方面明确CRKP感染的危险因素及预后，另一方面以COL、TGC为基础，联合其他临床常见抗菌药物，探究对MDRAB具有协同效应的联合用药方案，从而为临床防治耐药G-杆菌感染提供理论依据。 方法： 1.ICU患者感染CRKP的危险因素及预后分析：采用回顾性观察方法，选择2017年-2020年中国人民解放军总医院呼吸科重症监护室（Intensivecareunit，ICU）KP感染的住院患者为研究对象，根据碳青霉烯药敏结果分为CRKP组和碳青霉烯敏感KP（CarbapenemsensitiveKlebsiellapneumoniae,CSKP）组,采用单因素和多因素logistic回归分析比较两组的临床特征及相关因素暴露史，得到CRKP感染的独立危险因素,并评价患者的临床转归。 2.临床分离MDRAB的联合用药策略研究：（1）通过医院Pride病案系统明确4株多重耐药菌株AB034、AB239、AB536、AB767的临床背景。（2）全基因组测序阐明上述4株MDRAB的遗传背景，包括系统发育关系、多位点序列分型和耐药基因等。（3）微量肉汤稀释法测定临床常用抗菌药物COL、TGC、舒巴坦（Sulbactam，SUL）、阿米卡星（Amikacin，AMI）、美罗培南（Meropenem，MEM）、左氧氟沙星（Levofloxacin，LEV）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、磷霉素（Fosfomycin，FOS）、利福平（Rifampin，RIF）对上述4株MDRAB的最低抑菌浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）。（4）棋盘法测定以COL、TGC为基础联合SUL、MEM、LEV、CIP、FOS及RIF等临床常用抗菌药物对上述4株MDRAB的联合抑菌指数（Fractionalinhibitoryconcentrationindex，FICI），以初步筛选基于COL和基于TGC具有协同效应的联合用药方案，并用于后续研究。（5）通过目标药物组合的药代动力学参数构建体外药代动力学/药效学（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics，PK/PD）模型，模拟药物在人体药代动力学过程中对MDRAB的抗菌活性，治疗周期设定为48h，初始细菌接种量预设为1x10^6CFU/mL左右，绘制时间-杀菌曲线，并比较单药组、联合用药组的杀菌曲线下面积（Theareaunderthebacterialkillingcurve，AUBC）和48h菌落形成单位（Colonyformingunits，CFU）对数变化值（ΔLog10CFU0–48h），评价基于COL联合用药方案和基于TGC联合用药方案的协同效应，最后通过菌落谱型分析（Populationanalysisprofile，PAP）明确基于COL的联合用药方案对实验菌株产生异质性耐药的影响。（6）通过尾静脉注射最低致死量（Minimumlethaldose，MLD）的AB767菌株，在ICR小鼠中构建急性致死性血流感染模型，设置感染对照组（Control，感染未治疗）、COL单药组（低剂量组COLL、高剂量组COLH）、TGC单药组（低剂量组TGCL、高剂量组TGCH）、其他单药组（棋盘法、体外PK/PD模型筛选出的药物）、COL低剂量联合组、COL高剂量联合组、TGC低剂量联合组、TGC高剂量联合组，每组10只小鼠，并于给药24h后分析各组小鼠死亡率、主要器官（肝、脾、肺、肾）载菌量及各组存活小鼠血中载菌量，验证目标联合用药方案在体内的协同抗菌活性，并通过比较COL单药组和COL联合用药组血中分离菌株的异质性耐药率，在体内验证联合用药对异质性耐药的影响。 结果： 1.ICU患者感染CRKP的危险因素及预后分析：本研究共纳入138例患者，其中CRKP组97例，CSKP组41例。CRKP感染的独立危险因素包括同时存在≥3种基础疾病（OR=5.465，P=0.003）、既往住院史（OR=4.279，P=0.006）、喹诺酮类药物既往应用史（OR=5.872，P=0.012）及既往留置尿管（OR=5.035，P=0.000）。CRKP患者住院期间死亡率为42.1%，显著高于CSKP患者的17.5%（P=0.006）。 2.临床分离MDRAB的联合用药策略研究：（1）4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）来自不同的科室，除AB239来自尿液标本外，其余菌株均从痰液标本中分离，送检时间为2018、2019年。（2）AB034、AB239、AB536、AB767属于不同的ST分型，分别为ST368、ST191、ST195和ST540，并携带APH(3")-Ⅰb、OXA-23、tet(B)等常见抗菌药物耐药基因和AdeB、AdeR、AdeG、AdeJ等外排泵基因。（3）微量肉汤稀释法显示上述4株MDRAB对COL、SUL、MEM、FOS、CIP、LEV均耐药，MIC值为耐药折点的1-64倍，对RIF的MIC值均为2μg/mL（无耐药折点）；仅AB034和AB767对TGC敏感，AB536对AMI敏感；然而，AB034、AB239、AB767三株菌对AMI表现为高度耐药，MIC值均?8192μg/mL（128倍耐药折点），故后续实验不再纳入AMI。（4）棋盘法表明，在基于COL的用药组合中，COL分别与MEM、FOS的协同效果最强，对4株MDRAB的FICI均≤0.5；在基于TGC的用药组合中，TGC联合MEM的协同效果最强，FICI均≤0.5；因此，将COL+MEM、COL+FOS、TGC+MEM作为初步的联合用药方案。（5）在体外PK/PD模型中，时间-杀菌曲线显示，尽管4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）均对多黏菌素耐药，但COL+MEM、COL+FOS联合用药方案都具有较好的协同杀菌活性，AUBC、ΔLog10CFU0–48h相较于COL、MEM、FOS单药组，均显著降低。PAP结果显示，COL单用时实验菌株对COL异质性耐药高达64μg/mL，且随着COL剂量增加，高水平异质性耐药亚群比例随之增加，COL+MEM或FOS可显著抑制异质性耐药的产生。对于TGC+MEM联合用药方案，时间-杀菌曲线显示，其对TGC耐药菌株（AB239、AB536）几乎无效，仅对TGC敏感菌株（AB034、AB767）具有较好的协同效果，AUBC、ΔLog10CFU0–48h相较于单药组显著降低，可将CFU维持在相对较低的水平，但是该协同效果依赖于高剂量的TGC联合MEM，低剂量的TGC联合MEM协同效应并不显著，ΔLog10CFU0–48h与单药组相似。（6）AB767菌株所致血流感染对ICR小鼠的24hMLD为1x10^10CFU/mL（0.1mL/10g）。尾静脉注射MLD后，小鼠死亡率为100%，主要器官（肝、脾、肺、肾）载菌量均高达10^8CFU/mL，HE染色表明上述器官均有不同程度的坏死，组织破坏严重，提示急性致命性血流感染模型构建成功。在COL+MEM联合用药方案中，与Control组相比，各组死亡率均降低至20-30%，并且主要器官载菌量也显著降低，差异具有统计学意义（P?0.05）。与单药组相比，尽管COLH+MEM组可显著降低肝、肺、肾、血中载菌量（P?0.05），但脾中载菌量和死亡率无明显差异。此外，联合用药组异质性耐药率也有所降低。在COL+FOS联合用药方案中，FOS组死亡率为70%，其余各组死亡率下降较为明显，仅为10-30%。和Control组相比，各组主要器官载菌量均有下降（P大多?0.05）。与单药组相比，COLH+FOS组主要器官肝、脾、肺、肾中载菌量显著降低（P?0.05）。尽管COLH联合FOS时，可将血中载菌量控制在较低水平，但和COLH组相比并无显著差异。此外，联合用药组异质性耐药率也比COL单药组低。在TGC+MEM联合用药方案中，TGCL组死亡率高达70%，TGCH组、MEM组、TGCL+MEM组死亡率为20-30%，TGCH+MEM组可将死亡率降为0%。此外，TGCH+MEM组相较于单药组，各主要器官（肝、肺、肾）和血中载菌量显著降低（P?0.05），仅脾中载菌量无显著差异。 结论： 1.早期识别CRKP感染的高危患者并加以干预，如尽可能地减少住院史，合理使用喹诺酮类药物，降低侵入性有创操作的频次等，将有助于预防CRKP感染、改善患者预后。 2.4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）属于不同的ST分型，携带各种耐药基因和外排泵，对COL、SUL、MEM、FOS、CIP、LEV等多种临床常见抗生素耐药，仅AB034和AB767对TGC敏感，AB536对AMI敏感。 3.基于COL的联合用药策略研究发现，尽管本实验中的4株MDRAB均对COL耐药，但COL联合MEM或FOS在体内外实验中仍表现出较强的协同抗菌活性，并显著降低实验菌株发生COL高水平异质性耐药的风险，提示即使AB菌株表现为COL耐药，基于COL分别联合MEM或FOS的用药策略依然可行。 4.基于TGC的联合用药策略研究发现，TGC仅与MEM有较好的协同效应，即使用于血流感染，也可显著抑制TGC敏感菌株的生长。然而，该协同效果依赖于TGC的高剂量应用，并对于TGC耐药菌株几乎无抗菌活性。上述结果提示，对于TGC敏感MDRAB所致血流感染，高剂量的TGC联合MEM不失为一种有效的抗感染治疗方案。
NETL