摘要
目的：随意皮瓣是重建手术中广泛应用的关键技术之一，而皮瓣远端的坏死是皮瓣术后中最严重的并发症。缺血再灌注损伤被认为是导致皮瓣坏死的主要原因之一。褪黑素是一种有效的自由基清除剂，具有抗炎、抗氧化作用。本研究将通过体内和体外实验相结合，以研究褪黑素对大鼠随意皮瓣存活的影响，并探讨其可能涉及的机制。 方法：在体外，由于TBHP比H2O2具有更稳定的缓释特性，因此应用TBHP诱导HUVECs中的氧化应激损伤。为了探索褪黑素激活线粒体自噬的作用，本实验使用了一种已知的线粒体自噬诱导剂UA（40μM）作为阳性对照。之后，为了验证褪黑素诱导的HUVECs线粒体自噬作用，给予CsA（1μM）和Mdivi-1（1μM）作为线粒体自噬抑制剂，并检测自噬、凋亡以及氧化应激的变化。随后，我们利用siRNA敲低Parkin的表达，以探究Parkin蛋白在褪黑素诱导的线粒体自噬中的作用。最后根据细胞测序结果，使用CompoundC（40μM）作为AMPK的抑制剂并转染siRNA敲低TFEB的表达以研究AMPK-TFEB信号通路。 在体内，60只大鼠被分为4组；假手术组（n=6）；对照组（n=18）仅给予腹腔内注射溶媒作为对照；褪黑素组（n=18）术前1小时给予40mg/kg褪黑素腹腔内注射，并持续6天。褪黑素+CC组（n=18）在褪黑素给药前30分钟给予CompoundC1.5mg/kg/d。在术后第3天，进行激光多普勒扫描，以及皮瓣成活的大体照片拍摄。在术后第7天，用激光多普勒扫描大鼠，然后使其安乐死，并收集组织样本进行组织学、组织水肿分析以及MDA、GSH和SOD试剂盒的检测。 结果：褪黑素上调线粒体自噬相关指标，改善了TBHP诱导的HUVECs线粒体功能障碍和细胞凋亡相关指标。线粒体自噬抑制剂CsA与Mdivi-1下调了LC3、Parkin、PINK1的蛋白水平，并使得P62的表达水平上调，且在线粒体自噬被抑制的同时，也使得线粒体膜电位降低，ATP合成减少。根据我们的westernblot结果显示，给予褪黑素后，Parkin和PINK1的表达水平上调。电镜图像显示，当Parkin表达敲低后，线粒体损伤（包括线粒体空泡化、收缩和破裂）的发生率升高，线粒体自噬体较少。测序结果显示在TBHP治疗后TFEB基因表达丰度下调，而褪黑素给药后TFEB表达丰度上调。Westernblot结果显示，褪黑素给药后，AMPK的磷酸化水平升高，而当AMPK被抑制后Parkin和Tom20的共定位率下降，且Parkin和Tom20的免疫荧光染色也反映了线粒体自噬的水平减低。同时我们使用了siRNA敲低TFEB的基因表达，结果显示，当TFEB表达下降后褪黑素的抗氧化应激及抗凋亡的相关指标表达也下降了。 体内实验中我们发现褪黑素可以上调线粒体自噬相关指标并促进ROS清除、抑制细胞凋亡的发生。最终反应在皮瓣水肿的减轻，血管密度的提高、白细胞浸润的减少以及皮瓣存活率的提高。 结论：我们首次证明了在随意皮瓣中AMPK-TFEB信号通路与Parkin介导的线粒体自噬之间的关系。此外，褪黑素的抗氧化应激和抗凋亡作用主要是通过激活Parkin介导的线粒体自噬来实现的。这些发现证明了线粒体自噬在皮瓣存活中的保护作用，并提供了褪黑素促进皮瓣存活的有力证据。
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