摘要
水芹(Oenanthejavanica)是伞形科水芹属，多年生水生草本宿根植物，是我国的重要水生蔬菜之一，主要分布于长江流域及其以南地区。水芹具有多种营养、保健功能，深受消费者喜爱。目前水芹的遗传转化体系、基因沉默体系和基因敲除体系均未建立，在基因功能研究方面，缺乏相应的技术支持。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)具有操作简便、研究周期短、不需遗传转化等优点，己在多种单、双子叶植物中广泛应用。为更好地开展水芹基因功能的研究，我们基于黄瓜花叶病毒，建立了水芹基因沉默载体、开展了相关基因沉默应用研究。论文主要结果如下: 1、水芹中CMV的检测鉴定 以‘伏芹1号’(‘Fq1’)为试验材料，采用RT-PCR和westemblot技术，在水芹植株中检测到黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus，CMV)。扩增大小为547bp的片段，经Blastn比对和系统发育分析发现，其与CMV菜豆分离物(KT270563.1)、CMV番茄分离物(KC847076.1)和CMV西瓜分离物(KC878465.1)等的CP序列相似性高达99％，并且与埃及天竺葵分离物(JQ013954.1)、埃及甜菜分离物(MT491996.1)的遗传关系较近，均属于亚组IA。在江苏扬州采集的22份水芹样品中，该病毒的检出率达59.1％，表明该病毒在自然条件下能够侵染水芹。 2、水芹CMVVIGS体系的构建 以CMV-Fny侵染性克隆为基础，构建2b缺失突变载体pCB301-Fny2-2bdel，完成对水芹CMV-Fny侵染性克隆的改造。将改造后的CMVVIGS载体分别接种至本氏烟和水芹植株，利用RT-PCR和westernblot检测技术，均能检测到目的条带，说明改造后的CMVVIGS载体可以在本氏烟和水芹植株中应用。利用改造后的CMVVIGS载体分别沉默本氏烟PDS基因和水芹PDS基因，通过RT-PCR、westemblot和半定量检测，均能检测到目的条带，并且沉默PDS基因后，其表达量明显低于对照，说明本研究构建的水芹CMVVIGS载体可以用于水芹基因功能的研究。 3、水芹CMVVIGS体系的应用 利用水芹CMVVIGS载体，沉默水芹GID1基因。对沉默后的水芹植株进行观察发现，沉默GID1基因后的水芹叶片呈细长形态，植株明显矮化。同时，沉默GID1基因后，该基因表达量也显著低于对照。 利用水芹CMVVIGS载体分别沉默miR319和miR396，沉默水芹植株均出现明显的矮化表型，并且沉默miR319后植株叶片明显小于对照;通过荧光定量检测，沉默后水芹中的miR319和miR396表达量显著降低，而miR319的靶基因孔P2、TCP4和miR396的靶基因growth-regulatingfactor9-like的表达量均显著高于对照。
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