摘要
【研究背景】 泛素是由76个氨基酸组成的小分子蛋白质，其相对分子质量为8.5kDa左右，因其广泛的分布于真核细胞中而被命名。泛素化过程在蛋白质的降解、DNA损伤修复、免疫炎症以及细胞信号转导等多种细胞生物学的过程中均发挥了至关重要的作用。 泛素化过程是一个涉及三种酶的级联反应过程，分别是E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。根据泛素连接酶E3对靶蛋白的不同修饰方式可以将泛素修饰类型分为单泛素化修饰和多泛素化修饰，而多泛素化修饰又可以分为多位点的单泛素化修饰以及单个位点的多聚泛素化修饰，而目前已知的多聚泛素化修饰主要有以下8种类型，其中7种包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位的多聚泛素化修饰，而第8种多聚泛素化修饰类型即线性泛素化修饰，其通过泛素甲硫氨酸的氨基基团与另一个泛素分子的甘氨酸的羧基基团相连接而形成泛素链。到目前为止，对K11、K48和K63型多聚泛素链的研究较为深入，其中K11、K48型多聚泛素化链主要涉及蛋白质降解，K63型多聚泛素链主要涉及细胞信号转导通路的调节等，而其他几种多聚泛素链研究较少，其功能与机制还有待进一步的研究。 线性泛素化修饰在先天性免疫、抑制炎症反应、神经退行性疾病以及肿瘤等多方面均发挥了重要作用。线性泛素链组装复合体LUBAC（linearubiquitinchainassemblycomplex），是目前已知的唯一能够招募线性泛素链的E3，LUBAC最早于2006年由日本大阪大学的KazuhiroIwai教授实验室首次发现，当时认为LUBAC仅由两个亚基构成，包括HOIL-1L（longisoformofheme-oxidizedIRP2ubiquitinligase-1，又称RBCK1），HOIP（HOIL-1interactingprotein，又称RNF31），随后在2011年，三篇独立研究均发现了LUBAC的第三个关键亚基SHARPIN（SHANK-associatedRHdomaininteratingprotein）。到目前为止，学术界认为LUBAC这个复合体是由HOIP、HOIL-1以及SHARPIN这三个亚基所共同构成。 HOIP作为RBR家族的E3有着较多的结构域，并且不同的结构域分别与不同的蛋白质相互作用，进而发挥不同的功能：目前认为HOIP的N端PUB结构域负责结合去泛素化酶OTULIN（OTUdeubiquitinasewithlinearlinkagespecificity），ZF-NZF结构域负责结合泛素链或底物蛋白，UBA结构域负责结合HOIL-1和SHARPIN，而C端的RBR-LDD结构域负责结合E2执行E3功能。因为HOIP的不同结构域可以结合不同的蛋白质进而发挥不同的功能，所以我们通过构建和表达HOIP的不同结构域的截短体，分别与小鼠组织裂解液共同孵育，进行GSTpull-down，并结合质谱技术，鉴定LUABC新的相互作用蛋白或其调节亚基，从而构建小鼠重要组织器官中HOIP相互作用蛋白图谱。 在质谱筛选过程中，扣除GST空白对照中也鉴定到的蛋白，我们共鉴定到了2171个候选蛋白，其中PUB结构域富集到508个、ZF-NZF结构域511个、UBA结构域725个、RBR-LDD结构域427个，生物信息学分析显示所筛选的蛋白质主要富集于细胞代谢、转录调控过程以及细胞粘附相关等，提示我们线性泛素化修饰还有很多未知的新功能等待我们进一步探索，为以后线性泛素化修饰领域的发展提供了参考依据。 在上述的筛过程中我们验证了整合素连接激酶ILK（Integrinlinkedkinase）是线性泛素化修饰的新底物。ILK属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，位于整合素下游，在多种信号转导过程中起到一个中枢调节因子的作用，ILK可以调节细胞周期进程，在细胞生长，存活，EMT，细胞侵袭，迁移和血管生成等过程中均发挥着重要作用，拓展了线性泛素化修饰研究领域内容。本课题目前依旧存在本课题的研究意义在于，通过构建HOIP的不同截短体，在小鼠不同的组织器官中找寻LUBAC新的相互作用蛋白及其调节亚基，建立LUBAC相互作用图谱，拓展线性泛素化修饰领域研究内容。 【研究方法】 1.构建GST-HOIP截短体，GST-PUB、GST-ZF-NZF、GST-UBA、GST-RBR-LDD，在大肠杆菌中诱导、表达、纯化。 2.与6-8周龄的小鼠组织裂解液共孵育。 3.质谱鉴定结合蛋白。 4.生物信息学分析。 5.验证潜在的与HOIP存在相互作用的蛋白或其调节亚基： （1）免疫共沉淀（Co-IP）方法检测Myc-ILK与LUBAC的催化亚基Flag-HOIP之间相互作用。 （2）免疫荧光（IF）方法检测Myc-ILK与Flag-HOIP在细胞内共定位情况。 （3）免疫沉淀（IP）方法检测ILK在细胞内线性泛素化修饰水平。 （4）免疫沉淀法检测ILK线性泛素化修饰位点。 【研究结果】 1.成功构建并诱导、表达、纯化GST-HOIP截短体：GST-PUB、GST-ZF-NZF、GST-UBA、GST-RBR-LDD。 2.结合质谱结果分析显示，成功筛选出LUBAC候选相互作用蛋白（调节亚基）2171个，其中PUB结构域508个、ZF-NZF结构域511个、UBA结构域725个、RBR-LDD结构域427个。 3.ILK与HOIP相互作用验证： （1）免疫共沉淀（Co-IP）实验表明ILK与HOIP之间存在相互作用。 （2）体内Co-IP实验证明ILK与HOIP存在相互作用。 （3）GSTPull-down实验证明ILK与HOIP的UBA结构域相互作用，与质谱结果相一致。 （4）免疫荧光实验结果证实Myc-ILK与Flag-HOIP存在共定位。 （5）通过构建ILK截短体，体外Co-IP实验证实ILK通过C端激酶催化结构域与HOIP的UBA结构域相互作用。 4.ILK能够被LUBAC线性泛素化修饰，修饰位点为K209，K220。 5.LUBAC通过线性泛素化修饰ILK进而抑制ILK的激酶活性，进而影响ILK的底物AKT（S473）位点的磷酸化水平。 6.ILK能够破坏LUBAC复合体的稳定性。 【结论】 1.通过纯化HOIP蛋白截短体，利用质谱技术鉴定到LUBAC的潜在相互作用蛋白（调节亚基），为线性泛素化修饰研究领域提供了理论参考。 2.ILK是LUBAC的新底物。 3.LUBAC抑制ILK的激酶活性。 4.ILK破坏LUBAC复合体的稳定性。
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