摘要
背景： 原发性肝细胞肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是一类在全球范围内发病率和死亡率都极高的致死性疾病[1]。中国HCC新发病例和死亡病例都居世界首位，因此具有侵袭、转移及复发率高等特点的HCC严重威胁中国居民健康[1-4]。尽管早期/中期HCC患者采用手术切除和局部疗法，晚期HCC患者采用系统疗法，但HCC患者的5年生存率仍然只有7%，其主要原因是肿瘤的复发、转移和药物耐受。多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）具有抗血管生成和抗肿瘤细胞增殖的作用，是美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准的首个HCC分子靶向药物。然而，由于索拉非尼耐药，患者从索拉非尼治疗中获得的中位生存优势不到3个月[5,6]。尽管仑伐替尼（Lenvatinib）和FOLFOX4等新的一线靶向药物已被批准用于HCC，但临床试验表明，它们对总生存期的延长并不比索拉非尼更好[7,8]，索拉非尼仍是晚期HCC患者临床治疗的金标准，因此深入研究索拉非尼耐药机制至关重要。 已知索拉非尼耐药与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、肿瘤干细胞（Cancerstemcells，CSCs）和肿瘤微环境密切相关[9]。而RhoGTP酶（Rhoguanosinetriphosphatase，RhoGTPase）作为EMT相关信号通路的上游调控因子[10-12]，诱导肝癌索拉非尼耐药[13,14]，因此被认为是索拉非尼耐药治疗的有效靶点。RhoGTP酶是RasGTP酶（Rasguanosinetriphosphatase，RasGTPase）超家族中一小部分GTP酶（Guanosinetriphosphatase，GTPase），在基因调控、细胞周期和细胞迁移等细胞进程中发挥重要作用[15-17]。大多数RhoGTPases充当分子开关，在三磷酸鸟苷（Guanosinetriphosphate，GTP）结合的活化形式和二磷酸鸟苷（Guanosinediphosphate，GDP）结合的非活化形式之间循环。RhoGTPases的活性由鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guaninenucleotideexchangefactor，GEF）增加，该因子促进结合GDP的释放和随后更丰富的GTP的结合。而GTP酶激活蛋白（GTPaseactivatingprotein，GAP）刺激GTP的水解降低RhoGTPases活性[17]。然而，由于RhoGTPases和RasGTPases球状结构几乎没有小分子结合位点、对GTP或GDP结合的高亲和力，以及GTP在细胞中可用的微摩尔水平，它们之前被认为是“不可成药的”[18,19]。因此，通过竞争性抑制GEFs与其结合分子之间的相互作用来靶向Rho蛋白鸟嘌呤核苷酸交换因子（Rhoguaninenucleotideexchangefactors，RhoGEFs）被认为是目前癌症治疗中更有效的RhoGTPases抑制剂的选择[20]。 本课题通过人类蛋白质图谱数据库（TheHumanProteinAtlas）和癌症基因组图谱数据库（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）以及HCC患者队列，发现普列克同源包括RhoGEF结构家族成员5（PleckstrinhomologyandRhoGEFdomaincontainingG5，PLEKHG5）在HCC组织中的表达水平明显高于癌旁组织，因此其可能与HCC的发生发展有关。随后，我们发现在索拉非尼耐药的HCC细胞及耐药患者标本中PLEKHG5表达水平增高，提示其可能在肝癌索拉非尼耐药中发挥重要作用。对索拉非尼耐药细胞进行转录组测序（RNA-sequencing，RNA-seq），以进一步解析PLEKHG5的翻译后修饰和其激活RhoGTPases诱导索拉非尼耐药的分子机制。本研究从临床HCC患者队列及索拉非尼耐药细胞中鉴定了功能基因PLEKHG5，对PLEKHG5在肝癌发生发展及索拉非尼耐药中的作用提供分子机制，有望为临床索拉非尼耐药患者提供新的治疗靶点及用药策略。 实验方法： 1.验证PLEKHG5在HCC中发挥促癌作用。利用人类蛋白质图谱数据库和TCGA数据库以及从重庆医科大学附属第一医院肝胆外科收集到的HCC标本对PLEKHG5基因进行深度挖掘，明确其在HCC组织中的表达水平，并分析其与患者预后的相关性。利用CRISPR/Cas9系统构建PLEKHG5敲低（PLEKHG5knockdown，PLEKHG5KD）及PLEKHG5过表达（PLEKHG5overexpression，PLEKHG5OE）的HCC细胞模型，通过细胞增殖实验检测PLEKHG5对HCC细胞增殖能力的影响及对索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效的影响。 2.探索PLEKHG5诱导索拉非尼耐药的分子机制。通过低剂量索拉非尼药物诱导6个月以上，构建MHCC97H和PLC/PRF/5索拉非尼耐药（sorafenibresistant，SR）细胞模型（MHCC97HSR，PLC/PRF/5SR），并通过IC50实验和细胞凋亡实验验证细胞对索拉非尼的耐药性。对MHCC97HSR和MHCC97H细胞进行RNA-seq，对差异表达基因（Differentiallyexpressedgene，DEG）进行基因本体论（Geneontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）富集分析，发现差异表达基因主要富集在RhoGTPase活性、RhoGEF活性、组蛋白去乙酰化酶（Histonedeacetylase，HDAC）活性、PI3K/AKT和MAPK等信号通路。通过实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qRT-PCR）和Westernblot实验对索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5表达上调及Rac1/AKT/NF-κB信号通路的激活进行验证。通过Westernblot验证PLEKHG5过表达及敲低对Rac1/AKT/NF-κB信号通路的调控。采用NSC23766抑制PLEKHG5与Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-relatedC3botulinumtoxinsubstrate1，Rac1）的相互作用，通过细胞增殖实验和克隆形成实验观察NSC23766联合索拉非尼对HCC细胞增殖的影响，并通过Westernblot观察NSC23766联合索拉非尼对Rac1/AKT/NF-κB信号通路的影响。 3.探索组蛋白去乙酰化酶2（Histonedeacetylase2，HDAC2）调控PLEKHG5乙酰化修饰影响其蛋白稳定性的分子机制。通过免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）实验检测索拉非尼耐药细胞和敏感细胞中PLEKHG5乙酰化修饰水平。使用HDAC活性检测试剂盒检测索拉非尼耐药细胞和敏感细胞中HDACs的活性，探索调控PLEKHG5乙酰化修饰的HDACs。通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）和细胞免疫荧光（Immunofluorescence，IF）实验检测HDAC2与PLEKHG5的共定位及相互作用。通过免疫沉淀—质谱联用（Immunoprecipitation-massspectrometry，IP-MS）鉴定PLEKHG5乙酰化修饰位点。利用CRISPR/Cas9系统构建HDAC2敲除（HDAC2knockout，HDAC2KO）细胞模型。通过IP检测不同组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histonedeacetylaseinhibitor，HDACi）处理及HDAC2敲除对PLEKHG5乙酰化修饰的影响，验证HDAC2是PLEKHG5的生理性去乙酰化酶。通过环己酰亚胺（Cycloheximide，CHX）追踪实验检测HDAC2敲除及PLEKHG5乙酰化修饰位点突变对PLEKHG5蛋白稳定性的影响。 4.体内外验证抑制HDAC2增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。体外HDAC2敲除或采用HDAC2特异性抑制剂SantacruzamateA（CAY10683）与索拉非尼联合治疗，通过细胞增殖实验、克隆形成实验和细胞凋亡实验检测细胞增殖速率和凋亡水平的变化，并通过Westernblot检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。在小鼠原位肝癌模型中观察HDAC2敲除联合索拉非尼对肿瘤增殖的影响：通过腹腔注射二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine，DEN）和四氯化碳（Carbontetrachloride，CCl4）构建C57BL/6小鼠原位肝癌模型。设置索拉非尼药物治疗组，观察肝脏特异HDAC2敲除小鼠（Liver-specificHDAC2knockoutC57BL/6mice，HDAC2LKO）与野生型小鼠（Wild-type，WT）肿瘤体积及结节数的变化。通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化。通过Westernblot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。 在裸鼠皮下成瘤模型中观察HDAC2特异性抑制剂CAY10683联合索拉非尼对肿瘤增殖的影响：皮下注射MHCC97H细胞，设置对照组、索拉非尼治疗组、CAY10683治疗组和索拉非尼联合CAY10683治疗组，观察肿瘤体积的变化。通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化。通过Westernblot和IHC检测PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路的变化。 结果： 1.PLEKHG5在肝癌中发挥促癌作用。通过分析人类蛋白质图谱数据库、TCGA数据库及收集到的HCC患者标本，发现PLEKHG5在HCC中表达上调并与患者预后不良相关。通过PLEKHG5过表达及敲低细胞模型，我们发现PLEKHG5过表达促进HCC细胞增殖并降低索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效，而PLEKHG5敲低则结果相反，提示PLEKHG5在肝癌中发挥促癌作用。 2.PLEKHG5激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路诱导索拉非尼耐药。MHCC97HSR和PLC/PRF/5SR细胞对索拉非尼的IC50相较敏感细胞增高一倍（MHCC97HSR：22.29vs10.99μM；PLC/PRF/5SR：12.78vs5.067μM），不同索拉非尼浓度下耐药细胞的凋亡率明显低于敏感细胞，提示肝癌索拉非尼耐药细胞成功构建。RNA-seq结果显示差异表达基因主要富集在RhoGTPase活性、RhoGEF活性、HDAC活性、PI3K/AKT和MAPK等信号通路。qRT-PCR和Westernblot结果证实索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5表达水平升高及Rac1/AKT/NF-κB信号通路激活。此外，PLEKHG5过表达激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路而PLEKHG5敲低抑制Rac1/AKT/NF-κB信号通路，说明PLEKHG5激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路诱导索拉非尼耐药。使用NSC23766抑制PLEKHG5与Rac1的相互作用，抑制Rac1/AKT/NF-κB信号通路，从而抑制HCC细胞增殖并增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性，提示PLEKHG5可能是一个潜在的索拉非尼耐药治疗新靶点。 3.HDAC2调控PLEKHG5乙酰化修饰影响其蛋白稳定性。IP实验显示，索拉非尼耐药细胞中PLEKHG5蛋白表达升高且乙酰化修饰水平降低。在索拉非尼耐药细胞中HDAC2活性明显增强。进一步实验发现，HDAC2与PLEKHG5在细胞核内共定位且HDAC2与PLEKHG5的普列克同源（pleckstrinhomology，PH）结构域相互作用。IP-MS鉴定PLEKHG5的PH结构域内有3个高保守赖氨酸乙酰化修饰位点，提示PLEKHG5的乙酰化修饰与HDAC2有关。IP实验表明，仅在抑制HDAC2时PLEKHG5乙酰化修饰水平升高，说明HDAC2是PLEKHG5的生理性去乙酰化酶。CHX追踪实验显示，HDAC2调控PLEKHG5的PH结构域内三个赖氨酸位点乙酰化修饰影响PLEKHG5蛋白稳定性。 4.抑制HDAC2增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。体外实验表明，HDAC2敲除或CAY10683与索拉非尼联合治疗抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路，从而明显抑制HCC细胞增殖，促进HCC细胞凋亡。小鼠原位肝癌模型显示，HDAC2敲除联合索拉非尼抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路，从而明显抑制肿瘤体积大小和肿瘤结节数。裸鼠皮下成瘤模型显示，CAY10683协同索拉非尼抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路，从而明显抑制肿瘤体积大小。因此，抑制HDAC2联合索拉非尼可能是治疗肝癌索拉非尼耐药患者的新策略。 结论： 研究结果揭示了PLEKHG5是HCC和索拉非尼耐药的初始诱导因子，通过激活Rac1/AKT/NF-κB信号通路促进HCC发生发展并诱导索拉非尼耐药。HDAC2作为PLEKHG5的生理性去乙酰化酶，其与PLEKHG5共定位，调控PLEKHG5的PH结构域内三个赖氨酸位点的乙酰化修饰，影响PLEKHG5蛋白稳定性。体内外HDAC2敲除或药物抑制HDAC2，抑制PLEKHG5/Rac1/AKT/NF-κB信号通路，增强索拉非尼抗肿瘤细胞增殖疗效。本课题阐述了HDAC2活性增高及PLEKHG5表达增高诱导肝癌索拉非尼耐药的具体分子机制，对HDAC2和PLEKHG5参与索拉非尼耐药提供理论支持，有望为临床索拉非尼耐药患者提供新的疗法。
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