摘要
第一部分自主跑步锻炼对APP/PS1转基因AD小鼠认知功能的作用 背景：阿尔兹海默症（Alzhiemer’sdisease，AD）作为最常见的一种神经退行性疾病，已成为主要的社会公共卫生问题之一。跑步锻炼为一种非药物干预措施被证明可以有效改善AD的认知功能下降。在小鼠研究中，自主滚轮跑步锻炼相较于被动跑步机锻炼更能模拟人类的运动状态，并减少对小鼠的压力。长期自主跑步锻炼对APP/PS1转基因AD小鼠认知功能的作用尚未见研究报道。 目的：研究长期（3个月）自主滚轮跑步锻炼对APP/PS1转基因AD小鼠认知功能的影响，以及对相关AD病理的作用。以期进一步明确长期自主跑步锻炼对AD认知功能减退的治疗作用。 方法：80只10月龄雄性APP/PS1小鼠（AD）和同窝野生型小鼠（Wildtype，WT）随机分为不跑步组（Sedentarygroups，Sed）和跑步组（Runninggroups，Run），共4组（AD_Sed、WT_Sed、AD_Run和WT_Run，n=20只/组）。跑步组小鼠可以自由使用跑步轮3个月。13月龄时进行行为学检测评估小鼠的认知功能，包括新事物识别、水迷宫和Y迷宫实验。利用体视学方法中的Cavalieri’s原则对各小鼠海马的体积进行测量，利用硫黄素S染色（ThioflavinS，ThioS）观察小鼠海马Aβ斑块的沉积，通过对突触后致密蛋白（Postsynapticdensityprotein95，PSD95）的荧光染色观察小鼠海马的突触可塑性。 结果：WT_Sed、AD_Sed、WT_Run和AD_Run组小鼠的体重没有显著变化，WT_Run和AD_Run组小鼠的平均每日跑步路程也没有明显差异。新事物识别试验中，AD_Sed组小鼠的判别指数较WT_Sed组小鼠显著降低（plt;0.01），AD_Run组小鼠的判别指数较AD_Sed组小鼠显著升高（plt;0.01）。水迷宫实验中，AD_Sed组小鼠的平均路程和逃避潜伏期较WT_Sed组小鼠明显延长（plt;0.01；plt;0.001），AD_Run组小鼠的平均路程和逃避潜伏期较AD_Sed组小鼠明显缩短（plt;0.05；plt;0.01）。AD_Sed组小鼠的穿越平台次数较WT_Sed组小鼠显著下降（plt;0.01），AD_Run组小鼠的穿越平台次数较AD_Sed组小鼠显著升高（plt;0.05）。Y迷宫的正确率在4组小鼠之间没有显著差异。AD_Run组小鼠齿状回（Dentategyrus，DG）区和CA1区的体积较AD_Sed组小鼠显著增加（plt;0.05；plt;0.01），AD_Run组小鼠海马Aβ斑块的阳性区域面积较AD_Sed组小鼠显著减少（p（≤20μm）lt;0.05；p（＞20μm）lt;0.001）。AD_Sed小鼠海马PSD95的荧光强度较WT_Sed小鼠显著下降（p（DG）lt;0.01；p（CA1）lt;0.05；p（CA3）lt;0.01），而AD_Run组小鼠海马的PSD95的荧光强度较AD_Sed小鼠显著增加（p（DG）lt;0.01；p（CA3）lt;0.01）。 结论：长期自主跑步锻炼能够显著改善APP/PS1转基因AD小鼠的空间、学习记忆能力，增加AD小鼠海马DG区和CA1区的体积，降低AD小鼠海马区的Aβ斑块沉积，并增加AD小鼠海马DG区和CA3区PSD95的密度。 第二部分自主跑步锻炼对APP/PS1小鼠转基因AD小鼠海马内糖代谢的作用 背景：许多研究证实自主跑步锻炼能够有效减弱AD相关的病理表现，改善AD的认知功能。例如，自主跑步锻炼可以减轻AD模型小鼠的Aβ沉积和Tau蛋白磷酸化，促进AD小鼠的突触可塑性，促进AD小鼠海马的神经发生。但是，自主跑步锻炼改善AD认知功能相关的中枢机制研究仍然较少。 目的：利用转录组测序和影像学方法探索自主跑步锻炼减轻APP/PS1小鼠海马相关病理的潜在机制，以期找到跑步锻炼治疗AD认知障碍的中间靶点，为AD治疗寻找新方向。 方法：80只10月龄雄性APP/PS1小鼠（AD）和同窝野生型小鼠（WT）随机分为不跑步组（Sed）和跑步组（Run），共4组（AD_Sed、WT_Sed、AD_Run和WT_Run，n=20只/组）。跑步组小鼠自由使用跑步轮3个月。13月龄时分离出海马组织进行mRNA转录组测序，并进一步利用18-氟脱氧葡萄糖/正电子发射断层扫描（[18]F-fluoro-2-deoxy-d-glucose/positronemissiontomography，[18]F-FDG-PET）观察小鼠大脑葡萄糖代谢的情况。 结果：AD_Sed组小鼠和WT_Sed组小鼠相比，有115个基因显著上调，10个基因显著下调。在上调的差异基因中，有一些是疾病相关小胶质细胞（Disease-associatedmicroglia，DAM）关联的基因，例如：髓系细胞触发受体2（Triggeringreceptorexpressedinmyeloidcells2，Trem2），TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白（TYROproteintyrosinekinasebindingprotein，Tyrobp），整合素亚基αX（IntegrinsubunitalphaX，Itgax），分泌型磷蛋白1（Secretedphosphoprotein1，Spp1），Cd68和Cd74等。实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，qRT-PCR）证实Trem2，Tyrobp，Itgax，Cd68和Cd74在AD小鼠海马中显著上调（plt;0.01；plt;0.05；plt;0.01；plt;0.05；plt;0.001）。然而，AD_Run组小鼠和AD_Sed组小鼠相比，具有显著表达差异的基因很少。qRT-PCR也进一步证实DAM相关的基因在AD_Run组和AD_Sed组小鼠之间没有显著差异，包括Trem2，Tyrobp，Itgax，Spp1和Cd68。但是，利用基因集富集分析（Genesetenrichmentanalysis，GSEA）发现，与WT_Sed组小鼠相比，AD_Sed组小鼠海马中的“柠檬酸循环（TCAcycle）”，“糖酵解和糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）”，“磷酸戊糖途径（pentosephosphatepathway）”，“谷氨酸能突触（glutamatergicsynapse）”，“GABA能突触（GABAergicsynapse）”等通路显著降低。然而，与AD_Sed组小鼠相比，AD_Run组小鼠海马中的“丙酮酸代谢（pyruvatemetabolism）”，“糖酵解和糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）”，“果糖和甘露糖代谢（fructoseandmannosemetabolism）”，“磷酸戊糖途径（pentosephosphatepathway）”等通路显著上调。[18]F-FDG-PET实验进一步证实，长期自主跑步锻炼能够明显提高AD小鼠多个脑区的葡萄糖摄取水平，包括皮质（plt;0.001）、海马（plt;0.01）、丘脑（plt;0.01）、纹状体（plt;0.01）、下丘脑（plt;0.001）、杏仁核（plt;0.001）。长期自主跑步锻炼也明显提高WT小鼠皮质、海马、丘脑、纹状体、下丘脑和杏仁核的葡糖糖摄取水平（plt;0.001；plt;0.001；plt;0.001；plt;0.001；plt;0.001；plt;0.001）。 结论：长期自主跑步锻炼对AD小鼠海马内基因mRNA表达水平的作用很小，提示长期跑步锻炼对AD小鼠海马的调控可能发生在转录后水平。GSEA提示长期跑步锻炼能够恢复AD小鼠海马内的糖代谢相关通路，例如“丙酮酸代谢”，“糖酵解和糖异生”和“磷酸戊糖途径”。[18]F-FDG-PET进一步证实长期跑步锻炼能够显著促进WT小鼠和AD小鼠多个脑区的葡萄糖摄取水平。 第三部分自主跑步锻炼对APP/PS1转基因AD小鼠海马内小胶质细胞代谢活性和形态可塑性的作用 背景：小胶质细胞作为大脑的先天免疫细胞，在AD的病理进程中扮演着重要的角色。然而，小胶质细胞如何参与到跑步锻炼改善AD认知功能中的相关研究仍然较少。TREM2是表达于小胶质细胞上的免疫球蛋白超家族的一员，已知在调节小胶质细胞代谢活性、功能，以及大脑糖代谢水平中有着重要的作用。然而，跑步锻炼对小胶质细胞和大脑糖代谢的影响以及两者之间的关系仍然不清楚。 目的：阐明跑步锻炼对APP/PS1小鼠海马内小胶质细胞代谢、功能和形态的影响，初步探讨TREM2在跑步锻炼促进大脑小胶质细胞代谢和大脑糖代谢中的关系。 方法：80只10月龄雄性APP/PS1小鼠（AD）和同窝野生型小鼠（WT）随机分为不跑步组（Sed）和跑步组（Run），共4组（AD_Sed、WT_Sed、AD_Run和WT_Run，n=20只/组）。跑步组小鼠自由使用跑步轮3个月，13月龄时处死小鼠。利用免疫荧光、免疫印迹（Westernblotting，WB），或者酶联免疫检测法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）对小胶质细胞相关的葡萄糖转运蛋白（Glucosetransporter，GLUT5）、TREM2、可溶性TREM2（sTREM2）、TYROBP、SPP1和磷酸化脾酪氨酸激酶（Phospho-Spleentyrosinekinase，p-SYK）等进行检测。使用免疫组织化学、体视学方法和免疫荧光观察小胶质细胞的形态、增殖和活性。 结果：AD_Run组小鼠GLUT5的蛋白水平显著高于AD_Sed组小鼠（plt;0.05），AD_Run组小鼠DG区GLUT5+/IBA1+小胶质细胞比例显著高于AD_Sed组小鼠（plt;0.05）。同时，AD_Run组小鼠海马TREM2蛋白水平较AD_Sed组小鼠显著升高（plt;0.01），血浆中sTREM2水平较AD_Sed组小鼠显著下降（plt;0.05），sTREM2水平的下降与小鼠海马葡糖糖摄取水平呈显著负性相关（plt;0.01）。TREM2依赖蛋白SPP1的蛋白水平在AD_Run组小鼠海马中较AD_Sed组小鼠明显上调（plt;0.001），但TREM2适配器蛋白TYROBP在四组小鼠中没有明显差异。AD_Run组小鼠海马TREM2+/IBA1+小胶质细胞内出现更多的NeuN碎片，并且TREM2下游信号p-SYK（Tyr525/526）的蛋白表达水平较AD_Sed组小鼠显著升高（plt;0.01）。另外，AD_Sed组小鼠DG区和CA1区的小胶质细胞总数较WT_Sed小鼠显著升高（p(DG)lt;0.01；p(CA1)lt;0.05），AD_Run组小鼠DG区的小胶质细胞总数较AD_Sed组小鼠显著增加（plt;0.001）。AD_Run组小鼠DG区5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2’-deoxyuridine，BrdU）阳性细胞总数较AD_Sed组小鼠显著升高（plt;0.05），但AD_Run组和AD_Sed组之间的BrdU+/IBA1+小胶质细胞数量没有显著差异。AD_Sed组小鼠DG区的小胶质细胞分枝端点数和分枝长度较WT_Sed组小鼠显著减少（plt;0.001；plt;0.001），但AD_Run组小鼠DG区的小胶质细胞分枝端点数和分枝长度较AD_Sed组小鼠明显增多（plt;0.01；plt;0.05）。并且，AD_Run组小鼠海马Aβ斑块周围IBA1小胶质细胞的荧光强度显著减弱（plt;0.05），斑块周围CD68/IBA1的阳性区域面积比例也明显降低（plt;0.05）。 结论：长期自主跑步锻炼促进AD小鼠海马内小胶质细胞葡萄糖转运体GLUT5的表达，伴随着海马内TREM2和TREM2依赖蛋白SPP1的表达升高，以及血浆中sTREM2水平的降低。长期自主跑步锻炼还上调AD小鼠海马内TREM2/SYK通路促进吞噬。这些结果提示自主跑步锻炼能够促进AD小鼠海马内小胶质细胞的糖代谢和TREM2依赖的小胶质细胞功能，与TREM2的水解脱落成负性相关。另外，长期自主跑步锻炼能够显著增加AD小鼠海马DG区的小胶质细胞数量，小胶质细胞分枝端点数和分枝长度，并减少海马Aβ斑块周围IBA1和CD68的荧光强度。这些结果提示自主跑步锻炼能够增加小胶质细胞数量，恢复小胶质细胞的形态可塑性，并抑制小胶质细胞的过渡激活。尽管自主跑步锻炼能够增加AD小鼠DG区BrdU+新生细胞数量，但是对BrdU+/IBA1+新生小胶质细胞数量没有显著改变，提示自主跑步锻炼能够促进小胶质细胞类型以外的神经细胞发生，自主跑步锻炼增加小胶质细胞数量可能不是由于促进小胶质细胞新生引起的，而是促进小胶质细胞的存活引起的。
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