摘要
背景： 乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，目前医学上已明确认识到乳腺癌是一种全身性疾病，癌细胞转移无固定模式，区域淋巴结具有重要的生物学免疫作用，但不是癌细胞滤过的有效屏障，血行扩散更具有重要临床意义。随着对乳腺癌发病机制研究的不断深入和精准医学的持续发展，开发更有效的治疗方法对攻克乳腺癌具有重要意义。雌激素受体ESR1是大部分乳腺癌的主要驱动因子，它通过与雌激素结合介导细胞的增殖和存活，其蛋白表达与患者的生存率密切相关，是乳腺癌独立的不良预后因素，因此，ESR1成为乳腺癌的理想治疗靶点。 铁死亡是一种新型的细胞死亡形式，在癌症治疗中起着重要作用。它在形态学、生化学和遗传学上不同于细胞凋亡、坏死和自噬。主要是由脂质过氧化物和铁积累导致。放射治疗是乳腺癌一种高效的治疗方法，能够提高患者生存率，减少癌症复发率。主要通过使用电离辐射引起DNA双链断裂，诱导细胞周期阻滞、衰老和各种细胞死亡。目前主要应用在区域淋巴结照射、腋窝放疗、部分乳房照射以及大分割乳房切除术后放疗等方面。研究显示，电离辐射可以诱导癌细胞发生铁死亡，但是ESR1在电离辐射诱导铁死亡中的作用和机制尚不清楚。 目的： 探讨ESR1在电离辐射诱导铁死亡中的作用和调控机制，为乳腺癌放射治疗提供新的潜在靶点。 方法： 1.细胞株：ER+乳腺癌细胞T47D、MCF-7、Zr75-1,ER-乳腺癌细胞MDA-MB-231,人乳腺非肿瘤性上皮细胞MCF10A。以上述细胞为研究对象，分为假照组（sham）、照射组（IR）、铁死亡抑制剂+照射组（Fer-1+IR）、阴性对照组（siControl）、ESR1沉默组（siESR1）、阴性对照+照射组（siControl+IR）、ESR1沉默+照射组（siESR1+IR）和ESR1沉默+铁死亡抑制剂+照射组（siESR1+Fer-1+IR）。 2.照射条件：采用X-RAD320ix辐照仪，照射剂量8Gy，剂量率3Gy/min。（根据实验组先前量效研究所决定，8Gy条件下诱导效应最明显） 3.利用生物信息学手段，分析TCGA数据库数据，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，采用Cox比例风险回归模型进行单变量和多变量分析。 4.采用BODIPY581/591C11染色检测细胞内脂质过氧化水平；采用PhenGreenSK染色检测细胞内Fe2+变化；采用台盼蓝染色检测细胞死亡。 5.采用RNA干扰技术构建ESR1敲低模型。 6.采用RT-PCR和Westernblot分别检测相关基因的mRNA和蛋白水平的变化。 7.采用免疫共沉淀和泛素化实验检测蛋白结合和泛素化水平。 8.使用R版本4.0.3.进行统计分析。实验数据用均数±标准差(±SD)表示。两组独立样本之间采用独立t检验，多组独立样本间采用单因素方差分析，Plt;0.05则认为处理组与对照组相比具有统计学意义。（*Plt;0.05;**Plt;0.01;***Plt;0.001） 结果： 1.在TCGA数据库中，生存分析结果显示ESR1高表达，生存率低，预后差。 2.细胞经电离辐射处理后，与假照组相比，IR组脂质过氧化水平（5.72±1.18vs36.68±1.75,p＜0.01）和细胞死亡率增加（10.84±0.67vs45.16±3.72,p＜0.01）；与IR组相比，Fer-1+IR组细胞死亡率减少（45.16±3.72vs25.73±1.79,p＜0.01）。 3.细胞经ESR1敲低和电离辐射联合处理后，与假照组和IR组相比，siESR1+IR组细胞死亡率（11.74±1.16vs36.93±1.46vs58±1.94,p＜0.01）和脂质过氧化水平增加（8.69±1.38vs21.21±1.4vs34.47±1.74,p＜0.05）。此外，ESR1敲低引起铁死亡相关蛋白CD71表达增加。 4.ESR1过表达可以加速CD71蛋白的降解，表明ESR1调控CD71的蛋白稳定性；细胞经蛋白酶体抑制剂MG132处理后，阻止了因ESR1敲低造成的CD71蛋白水平的下降，表明ESR1降解CD71是通过蛋白酶体途径。 5.细胞在过表达ESR1和敲低NEDD4L联合处理下，CD71蛋白水平得到了恢复。免疫共沉淀和泛素化实验结果显示ESR1可以增强NEDD4L与CD71的结合，促进CD71的泛素化和降解。 6.细胞在电离辐射和敲低ESR1联合处理下，与siESR1+IR组相比，siCD71+siESR1+IR组脂质过氧化水平（37.57±1.05vs21.87±1.37,p＜0.01）和细胞死亡率降低（37.58±0.87vs30.13±1.17,p＜0.05）。 结论： 1.电离辐射可以诱导ER+乳腺癌细胞发生铁死亡。 2.ESR1参与电离辐射诱导的铁死亡。 3.机制上，ESR1降解CD71通过蛋白酶体途径，ESR1增强NEDD4L与CD71的结合，促进CD71泛素化和降解，从而抑制电离辐射诱导的铁死亡。 4.ESR1/NEDD4L/CD71轴可能成为乳腺癌放射治疗的潜在靶点。
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