摘要
第一部分下丘脑FSTL1的表达及与肥胖的关系 目的：初步探索下丘脑FSTL1表达与肥胖的关系。 方法：通过免疫荧光检测12周龄C57BL/6J小鼠下丘脑FSTL1蛋白表达和分布。通过WesternBlot检测普食和高脂喂养12周的C57BL/6J小鼠和ob/ob，db/db下丘脑FSTL1蛋白表达，探索FSTL1与肥胖的关系。为了探讨下丘脑FSTL1与营养状态的关系，对12周龄C57BL/6J小鼠进行禁食及再喂养干预，检测不同营养状态下丘脑FSTL1蛋白表达水平。 结果：免疫荧光结果提示FSTL1蛋白在下丘脑ARC，VMH和DMH均有表达。高脂喂养的C57BL/6J小鼠和db/db/，ob/ob小鼠下丘脑FSTL1蛋白水平较普食对照组下降。禁食可以促进下丘脑FSTL1蛋白表达，再喂养后FSTL1蛋白水平下降到与自由摄食状态时一致。 结论：FSTL1在下丘脑ARC等多个核团表达，并与肥胖及营养状态相关，提示FSTL1可能参与下丘脑调节摄食及能量代谢。 第二部分下丘脑FSTL1对摄食及外周能量代谢调控作用的体内研究 第一节下丘脑过表达FSTL1对摄食及能量代谢的影响及体内机制 目的：探索下丘脑过表达FSTL1对摄食及外周能量代谢的影响。 方法：6周龄C57BL/6J小鼠随机分成4组，第3脑室定位注射AAV-GFP和AAV-FSTL1病毒，并给予普食或高脂喂养12周，测定各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT等代谢指标，同时对各组小鼠下丘脑组织进行转录组测序分析。各组小鼠禁食及再喂养干预后通过免疫荧光检测FSTL1过表达后对AgRP，POMC和c-fos表达的影响，同时RT-PCR检测POMC，AgRP和NPY转录水平的变化。各组小鼠胰岛素刺激后提取下丘脑组织蛋白，通过Westernblot检测过表达FSTL1对胰岛素信号通路的影响。 结果：与对照组相比，高脂组中下丘脑过表达FSTL1引起摄食、体重减少，肛温升高，糖耐量及胰岛素耐量曲线下面积减少。下丘脑FSTL1过表达引起禁食状态下AgRP蛋白及mRNA水平下降和c-fos蛋白减少。转录组测序结果提示FSTL1过表达引起PI3K-AKT-FoxO1通路改变，通过Westernblot进行验证，结果提示下丘脑过表达FSTL1促进AKT及FoxO1磷酸化，FoxO1出核增加。 结论：下丘脑过表达FSTL1可能通过AKT-FoxO1-AgRP信号通第二节AgRP神经元过表达FSTL1对摄食及能量代谢的影响 目的：通过AgRP神经元过表达FSTL1，探索FSTL1在AgRP神经元调控摄食及能量代谢中的作用。 方法：将6周龄AgRP-cre小鼠随机分成4组，中枢ARC区定位注射AAV-DIO-GFP或AAV-DIO-FSTL1病毒，并给予普食或高脂喂养12周，监测各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT、呼吸熵等代谢指标。病毒过表达12周时各组予以禁食和再喂养干预，通过下丘脑免疫荧光染色观察FSTL1过表达对AgRP，POMC，FoxOl和c-fos表达的影响。通过HE染色观察各种小鼠肝脏、iWAT和BAT形态，油红O染色观察肝脏脂质沉积，免疫组化染色检测棕色脂肪UCP1表达。病毒注射4周时小鼠行侧脑室PI3K抑制剂输注，检测小鼠摄食量及GTT、ITT等指标，免疫荧光染色检测AgRP蛋白改变。 结果：高脂组AgRP神经元过表达引起摄食及体重下降，糖耐量及胰岛素耐量曲线下面积减少，小鼠氧耗和脂质氧化供能增加，呼吸墒和碳水合物氧化供能降低。过表达组肝脏脂质沉积减少，棕色脂肪UCP1表达增加。免疫荧光染色提示禁食状态下过表达组AgRP，c-fosamp;nbsp;表达减少，FoxOl出核增加。侧脑室PI3K抑制剂输注可以抑制FSTL1过表达引起的摄食抑制及血糖改善等效应。 结论:AgRP神经元FSTL1过表达通过AKT-FoxO1-AgRP通路调控摄食和外周能量代谢。 第三节FoxOl介导FSTL1在AgRP神经元中对摄食及能量代谢的调控作用 目的：通过在AgRP神经元FoxO1敲除小鼠过表达FSTL1，验证FSTL1调控摄食及外周能量代谢的通路机制。 方法：将6周龄AgRP-cre和AgRP神经元FoxO1条敲小鼠随机分成4组，下丘脑ARC定位注射AAV-DIO-GFP和AAV-DIO-FSTL1病毒，并给予HFD喂养12周，监测各组小鼠摄食、体重、肛温、GTT、ITT等代谢指标。病毒注射12周时小鼠禁食后取下丘脑行免疫荧光染色检测AgRP蛋白。各组小鼠取肝脏，iWAT和BAT进行HE染色和油红O染色，免疫组化检测棕色脂肪UCP1表达。 结果：AgRP神经元特异性过表达FSTL1后引起摄食减少，体重减轻，产热增加并改善糖代谢改善，但AgRP神经元FoxO1敲除鼠FSTL1过表达没有引起上述代谢改变。 结论：AgRP神经元过表达FSTL1通过FoxO1调控摄食及能量代谢。 目的：在体外层面探索FSTL1调控摄食及外周能量代谢的机制。 方法:在SH-SY5Y和GT1-7细胞系中利用慢病毒过表达FSTL1，或在GT1-7细胞中利用慢病毒敲低FSTL1，结合葡萄糖胺和胰岛素处理，探索FSTL1调控代谢的分子机制；通过提取细胞质/细胞核蛋白或细胞免疫荧光染色，观察FSTL1过表达/敲低对于FoxO1核质分布的影响。此外，通过PI3K抑制剂干预进一步验证FSTL1是否通过激活AKT发挥作用。激光共聚焦共定位和免疫共沉淀验证FSTL1和AKT的相互作用。 结果：SH-SY5Y和GT1-7细胞过表达FSTL1后引起p-AKT,p-FoxO1表达增加，促进FoxO1出核，而PI3K抑制剂可以阻断上述效应。GT1-7细胞敲低FSTL1后表现出p-AKT,p-FoxO1表达减少，FoxO1出核比例减少。激光共聚焦共定位和免疫共沉淀结果提示FSTL1和AKT之间存在相互作用。 结论:FSTL1可通过与AKT相互作用从而影响AKT-FoxO1-AgRP信号通路。
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