摘要
目的：肝缺血再灌注损伤（hepaticischemia/reperfusioninjury，HIRI）是一种复杂的病理生理过程，包含凋亡失调、炎症失控等复杂多样的病理损伤机制。在缺血期，肝脏主要产能方式发生改变，由氧化磷酸化转化为无氧糖酵解，可导致肝组织内乳酸蓄积、酸性微环境形成等一系列病理改变。乳酸脱氢酶A（lacticdehydrogenaseA,LDHA）是糖酵解最后一步的关键酶，催化丙酮酸生成乳酸。G蛋白偶联受体81（G-protein-coupledreceptor81,GPR81）是乳酸的内源性受体，可在炎症反应中发挥重要调控作用。本研究在肝缺血再灌注损伤模型中探讨了LDHA及GPR81对肝组织损伤的影响及机制。 方法：为探讨LDHA对肝缺血再灌注损伤的影响，我们将LDHA抑制剂NHI-2在肝缺血前2h经腹腔注入雄性C57BL/6J小鼠，随后进行缺血及再灌注手术操作，于再灌注6h后收集样本。首先，为探讨LDHA抑制剂NHI-2是否影响乳酸生成，我们检测了肝组织中乳酸与丙酮酸水平，并计算了两者的比值。随后，为探讨LDHA抑制剂NHI-2是否影响肝缺血再灌注损伤的发生发展，我们检测了血清转氨酶丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase,ALT）水平 并对肝组织进行形态学分析；为探讨LDHA抑制剂NHI-2是否通过调控肝细胞凋亡影响肝缺血再灌注损伤，我们检测了肝组织caspase-3活性并对肝组织切片进行TUNEL染色及镜下观察；我们也检测了血清白介素6（interleukin-6,IL-6）水平，了解其对全身炎症反应的影响。 为进一步明确LDHA对肝缺血再灌注损伤的影响，我们分别在GTEx数据库和TheHumanProteinAtlas数据库检索了各组织、细胞中LDHA的表达情况，并基于检索结果繁育了肝细胞特异性LDHA敲除小鼠（hepatocyte-specificknockoutofLDHA,LDHA-HKO）进行进一步验证。首先，我们将LDHAflox/flox小鼠与Alb-Cre小鼠合笼，最终得到LDHAflox/floxxAlb-Cre基因型的LDHA-HKO小鼠以及作为WT对照的LDHAflox/flox基因型同窝鼠。随后，我们在LDHA-HKO小鼠及WT小鼠中复制了肝缺血再灌注损伤模型，并于再灌注6h后收集血清及肝组织样本。为明确LDHA-HKO对肝缺血再灌注损伤的影响，我们检测了血清转氨酶ALT水平，并对肝组织进行形态学分析。为探讨LDHA是否通过调控肝细胞凋亡影响肝缺血再灌注损伤，我们检测了肝组织caspase-3活性并对肝组织切片进行TUNEL染色。为评估其对全身炎症反应的影响，我们对血清IL-6进行了检测。最后，为探讨LDHA对肝缺血再灌注损伤发挥作用的具体机制，我们对LDHA-HKO小鼠及WT小鼠肝组织样本（再灌注6h后收集）进行转录组测序并进行相关生物信息学分析。 为探讨乳酸受体GPR81对肝缺血再灌注损伤的影响，我们将GPR81激动剂3-氯-5-羟基苯甲酸（3-chloro-5-hydroxybenzoicacid,CHBA）在肝缺血前2h经腹腔注入雄性C57BL/6J小鼠，随后进行缺血、再灌注手术操作，于再灌注6h后收集样本。为评估CHBA对肝损伤程度的影响，我们检测了血清转氨酶ALT、AST，并通过HE染色对肝组织进行形态学分析；为评估CHBA对肝缺血再灌注损伤时全身炎症反应的影响，我们检测了血清炎症因子IL-6及肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactoralpha,TNF-α）的水平；为评估CHBA对肝缺血再灌注损伤过程中远隔器官损伤的影响，我们分别检测了肺组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）蛋白浓度、血清脑钠肽（brainnatriureticpeptide,BNP）和血清肌酐（creatinine,Cr）水平并对肺组织切片进行HE染色和形态学分析。 为进一步探讨GPR81在肝缺血再灌注中的作用，我们繁育了GPR81基因敲除鼠进行验证。首先，我们将GPR81flox/flox小鼠与Alb-Cre小鼠合笼，最终得到GPR81flox/floxxAlb-Cre基因型的GPR81-HKO小鼠以及作为野生型（wildtype,WT）对照的GPR81flox/flox基因型同窝鼠。此外，我们也繁育了GPR81全身敲除小鼠，将GPR81+/-小鼠合笼，得到GPR81敲除（GPR81-knockout）小鼠以及同笼WT小鼠。随后，利用以上小鼠复制肝缺血再灌注模型并检测了血清转氨酶、炎症因子的水平以及肝组织形态学的变化。 结果：使用LDHA抑制剂NHI-2处理后，肝组织乳酸水平并无明显改变、肝组织丙酮酸水平、乳酸/丙酮酸比也无明显变化。与LDHA抑制剂NHI-2干预结果相符，LDHA-HKO对肝组织乳酸水平也无明显影响，肝组织丙酮酸水平及乳酸/丙酮酸比也无明显变化。 LDHA抑制剂NHI-2加重肝缺血再灌注损伤，表现为血清转氨酶水平以及肝组织病理评分升高。LDHA抑制剂NHI-2也可加重肝缺血再灌注损伤引起的肝细胞凋亡，表现为肝组织caspase-3活性上调且TUNEL染色阳性细胞数增加。此外，LDHA抑制剂NHI-2使得肝缺血再灌注损伤模型小鼠血清IL-6水平上调，提示全身炎症反应加重。 通过GTEx数据库及TheHumanProteinAtlas数据库检测发现，LDHA在肝脏、肝细胞高表达。与NHI-2干预结果相符，LDHA-HKO组血清转氨酶水平、肝组织病理评分、肝组织caspase-3活性及TUNEL染色阳性细胞数较WT组均明显升高，提示LDHA-HKO加重肝缺血再灌注损伤。相较WT组，LDHA-HKO组小鼠血清IL-6水平明显升高，表明LDHA-HKO小鼠肝缺血再灌注损伤全身炎症反应加重。 将肝组织转录组测序结果进行DESeq2差异表达分析，发现LDHA-HKO组与WT组相比共有差异基因1468个。火山图结果显示，P-value≤0.05、|log2FC|≥1范围内，有下调基因144个、上调基因140个，共284个差异基因。对此284个差异基因进行KEGG富集分析可得，PI3K/Akt信号通路显著富集，有9个差异基因与PI3K/Akt信号通路相关（（P-value≤0.05、|log2FC|≥1）。此外，通过String数据库检索可得，LDHA蛋白与Akt蛋白存在相互关联。 GPR81激动剂CHBA对肝缺血再灌注损伤中肝损伤无明显影响，表现为I/R+CHBA组与I/R组血清转氨酶ALT和天冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase,AST）水平、肝组织病理评分均无明显差异。然而，较I/R组，I/R+CHBA组血清炎症因子IL-6及TNF-α水平显著升高，提示CHBA干预可明显加重肝缺血再灌注损伤全身炎症反应。与此一致，CHBA干预使得肝缺血再灌注损伤引起的远隔器官损伤明显加重，表现为I/R+CHBA组小鼠肺组织MPO水平、BALF蛋白浓度、肺组织病理评分较I/R组明显升高，血清BNP及Cr水平较I/R组明显上调。GPR81-HKO小鼠肝缺血再灌注引起的肝损伤及血清IL-6水平都无明显变化；而GPR81-KO组小鼠肝缺血再灌注引起的肝损伤无明显改变，血清炎症因子IL-6水平明显下调，与CHBA干预结果相符。 结论：本研究结果表明，抑制LDHA或敲除肝细胞中的LDHA可显著加重缺血再灌注诱导的肝组织损伤，LDHA可能通过调控PI3K/Akt信号通路在肝缺血再灌注损伤中发挥保护作用；激活GPR81、敲除肝细胞中的GPR81或敲除全身GPR81对肝缺血再灌注损伤无明显影响，但GPR81可加重肝缺血再灌注损伤引起的全身炎症反应及远隔器官损伤。
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