摘要
高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKp）可在健康的年轻人中引起危及生命的社区获得性感染，引起了全球广泛的关注。它的感染出现在多个部位，可导致肺炎、肝脓肿、坏死性筋膜炎、眼内炎和脑膜炎。其中hvKp引起的社区获得性肺炎（community-acquiredpneumonia,CAP）与引起全球CAP的第一大病原菌肺炎链球菌相比，其死亡率和呼吸衰竭率更高，因此hvKp肺部感染尤为值得关注。本研究旨在利用RNA测序（RNASequencing,RNA-Seq）转录组分析描述病原体感染期间宿主基因表达的动态变化，并初步探索其免疫致病机制，为全面而深入的了解hvKp肺部感染致病机制奠定基础。 首先我们通过气溶胶肺递送接种建立了小鼠急性原发性hvKp肺炎模型，并利用RNA-Seq获取了小鼠模型的0、12、24、48和60h肺部感染时间序列转录图谱。获得的RNA-Seq数据使用时间表达模式聚类、基因共表达网络分析和小鼠免疫细胞丰度标识符进行了综合分析，观察到了肺部转录谱的逐渐变化，详实地展现了疾病的发展进程。转录谱显示在感染后12h（hourspost-infection,hpi），急性期炎症反应相关基因表达大量增加，炎症反应过程可能受脂质代谢的正调控；在感染后24h，炎症加剧，活跃的IFN-γ信号传导促进了巨噬细胞的激活和招募；在感染整个过程中，肺组织结构相关基因表达持续下降，在48h下降尤为明显。TNF、IL-17、MAPK和NF-kB信号通路在感染的各个阶段的免疫致病机制中发挥关键作用。感染后自然杀伤细胞的丰度持续下降，这在hvKp感染中很少被报道，可以为治疗提供一个新的靶点。基因Saa1和Slpi在感染期间明显上调。Saa1与引起宿主炎症反应的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）有关，而Slpi编码一种抗菌蛋白，这两个基因目前在hvKp感染中没有被报道过，可能是后续研究的重要靶标。 随后，我们根据免疫信号通路提示重点筛选了12个细胞因子，鉴定了其在hvKp肺部感染中的作用。结果显示GM-CSF、IL-6、IFN-γ、TNF-α和MCP-1封闭后小鼠感染hvKp的生存率显著下降，这5个促炎细胞因子可以保护宿主免受肺部感染hvKp的死亡。由于IL-6和TNF-α是NF-kB信号通路中的关键细胞因子，这也验证了NF-kB信号通路在hvKp肺部感染宿主免疫应答中的重要作用。研究还发现抗炎细胞因子IL-10封闭后小鼠的生存率在早期有较高于对照组的趋势，但后期则与对照组持平，提示IL-10在肺部感染早期发挥的抗炎作用不利于小鼠存活。 最后，我们重点评估了转录组分析中呈持续上升趋势的肺泡巨噬细胞（alveolarmacrophages,AMs）在抗hvKp肺部感染中的贡献。通过AMs肺部清除实验，我们发现AMs清除会导致hvKp感染小鼠全部迅速死亡，与非清除小鼠相比，死亡率急剧升高，肺部菌载量显著增多，肺部组织损伤更加严重，病理与流式细胞术检测结果均显示中性粒细胞募集加剧，细胞因子测定结果显示肺泡灌洗液中的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6及趋化因子MIP-2、CXCL-1和MCP-1水平显著升高，抗炎细胞因子IL-10水平在感染早期低于对照小鼠，但在晚期高于对照小鼠。上述结果表明AMs缺乏导致肺部炎症与细菌增殖加剧，验证了AMs在hvKp肺部感染中发挥的抗炎和抗菌功能。此外AMs可能参与IL-10的早期分泌，AMs清除导致IL-10分泌滞后可能是小鼠肺损伤加剧和细菌清除减弱的原因之一。 本研究首次从转录组学角度分析了hvKp气溶胶感染肺部反应的特征变化，并筛选了hvKp肺部感染中具有治疗意义的细胞因子，同时鉴定了AMs作为肺抗菌宿主防御中的关键效应细胞的重要性。本研究结果可增进人们对于hvKp肺部感染分子机制的认识，并为hvKp肺炎治疗新方法的研发提供线索。
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