摘要
目的： 利用链霉亲和素-生物素（SA-Biotin）系统从噬菌体抗体库中筛选针对KRASp.G13D位点特异性强、亲和力高的。通过测序分析得到单链抗体基因序列，将目的基因序列进行修饰后装载至人源性肿瘤疫苗载体上，获得KRASp.G13D位点突变的肿瘤DNA疫苗，为KRASp.G13D位点突变的肿瘤提供新的治疗方法。 方法： 1.从GenBank中检索出人源化的KRAS基因序列，将基因序列进行设计，在其N端添加Avi、His标签，使其成为含有Avi、His的KRASp.G13D位点突变的基因，交由湖北生物技术有限公司进行合成、表达、鉴定及生物素化。 2.利用链霉亲和素-生物素系统，从噬菌体抗体库中筛选出能与KRASp.G13D突变型抗原特异性结合的单链抗体，交由华大基因科技有限公司进行测序分析，获得单链抗体基因序列。 3.将获得的单链抗体基因序列修饰后进行全基因序列合成，得到含有单链抗体基因序列的质粒并进行扩增。利用酶切系统将单链抗体基因序列从质粒上切下，并与人源性肿瘤疫苗载体连接，构建针对KRASp.G13D位点突变的人源性肿瘤疫苗，并进行测序确认。 4.将人源性肿瘤疫苗利用脂质体载体转染T84细胞表达并进行杀伤实验，验证人源性肿瘤疫苗的效能。 结果： 1.成功合成生物素化的KRASp.G13D重组蛋白并筛选出2条单链抗体，通过基因测序获得目的单链抗体基因序列。 2.将获得的单链抗体基因序列连接至人源性肿瘤疫苗载体上测序验证，获得针对KRASp.G13D位点突变的肿瘤DNA疫苗。 3.将成功构建的2条肿瘤DNA疫苗进行细胞验证，利用SPSS统计软件对获得数据进行分析，结果表明肿瘤疫苗1对含有该突变及野生型细胞均具有明显杀伤作用；肿瘤疫苗2对含有该突变肿瘤细胞具有较强杀伤作用，但对KRAS野生型细胞也具有一定杀伤作用。 结论： 本实验成功合成生物素化的KRASp.G13D重组蛋白并筛选出2条单链抗体。将负载该单链抗体的肿瘤疫苗进行生物学验证，证明肿瘤疫苗对含有该突变肿瘤细胞具有较强杀伤作用。
NETL