摘要
低频超声辐照联合自噬阻断抗小鼠4T1乳腺癌的实验研究 目的:探讨低频超声辐照联合自噬阻断对小鼠4T1乳腺癌生长和侵袭的影响。 方法:取对数生长期的4T1细胞，分为对照组，超声（US)组，羟氯喹（HCQ)组，US+HCQ组。蛋白质免疫印迹检测LC3、p62的表达水平;透射电镜观察细胞内自噬体的形成;CCK-8测定细胞的增殖与细胞活力;Transwell法测定细胞侵袭力;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;构建4T1乳腺癌小鼠皮下移植瘤模型，随机分为4组，每组5只:对照组、US组、HCQ组、US+HCQ组，每两天测量肿瘤体积及小鼠体重。 结果:US+HCQ组LC3-Ⅱ与p62的蛋白水平表达增加（均P＜0.05)，透射电镜可见细胞内明显自噬体积累;在细胞实验中，与其他三组相比，US+HCQ组的生长抑制作用更强，并能明显抑制侵袭（均P＜0.05);在体内实验中，与对照组相比，各组小鼠肿瘤生长速度均有下降（均P＜0.05)，US+HCQ组治疗效果更优（均P＜0.05)。 结论:低频超声辐照联合自噬阻断能够协同抑制肿瘤细胞活力，促进细胞凋亡，明显减缓4T1荷瘤小鼠肿瘤生长。 携载HCQ的pH/超声双重响应纳米液滴的制备与研究 目的:制备负载自噬抑制剂HCQ的纳米液滴（HCQ-NDs),并对其表型、pH响应与超声响应释药、超声显影能力、肿瘤靶向性进行研究。 方法:采用均质/乳化方法制备HCQ-NDs;利用透射电子显微镜来确定NDs的形态和结构，纳米激光粒度仪检测NDs在不同pH条件下的粒径、分散度及ζ电位;利用紫外分光光度计检测在不同pH及超声条件下的药物释放;采用流式细胞术与共聚焦显微镜检测NDs的细胞摄取途径;通过超声对比成像验证体内外增强超声显影的效果;通过荧光活体成像评估纳米液滴在小鼠体内的生物分布及肿瘤内的富集规律。 结果:在中性环境中NDs粒径小且均一，ζ电位为负电荷，而在酸性环境中发生扩张和聚集，ζ电位由负变正;酸性pH和超声辐照可以促进HCQ-NDs的药物释放(均P＜0.05);共聚焦显微镜证实NDs通过溶酶体途径进入细胞内，且超声辐照可以促进细胞对NDs的摄取（P＜0.05)。在体内外超声造影模式下NDs和HCQ-NDs均表现出持久的高回声信号。荧光活体成像结果显示NDs能够长滞留于肿瘤内，并在注射后2小时达到最大富集。 结论:成功制备了携载羟氯喹的超声纳米液滴，其具有pH响应的电荷转换、血清稳定性、超声增强成像能力和pH和超声响应的药物控释能力，可以高效靶向并渗透肿瘤。 UTMD联合HCQ-NDs抗肿瘤生长及转移的实验研究及机制 目的:探讨UTMD联合HCQ-NDs对肿瘤生长及转移的治疗效果及机制。 方法:取对数生长期的4T1细胞，分为对照组，NDs组，NDs+US组，游离HCQ组，HCQ-NDs组，HCQ-NDs+US组。蛋白质免疫印迹检测细胞LC3、p62的表达水平;透射电镜观察细胞内自噬体的形成;激光共聚焦显微镜观察细胞自噬流;CCK-8测定细胞活力:流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;划痕实验及Transwell法测定细胞迁移、侵袭力;构建4T1乳腺癌小鼠皮下移植瘤模型，分别对荷瘤小鼠的肿瘤大小、体重变化进行监测，通过对组织学切片的形态学分析、免疫组化检测肿瘤凋亡、增殖水平以及生物安全性。构建4T1乳腺癌小鼠肺转移瘤模型，通过对肺表面结节以及H&E染色验证联合疗法对肿瘤转移的效果，通过免疫组化检测肿瘤MMP2、MMP9的表达。 结果:联合治疗后细胞自噬过程停滞在自噬体阶段;在细胞实验中，HCQ-NDs+US组的杀伤作用更强，并能明显抑制肿瘤迁移、侵袭（均P＜0.05);体内实验中，HCQ-NDs+US组肿瘤生长速度最慢，肿瘤重量最小（均P＜0.05);组织学切片染色显示HCQ-NDs+US组肿瘤内凋亡水平最高，增殖最低（均P＜0.05);各组治疗均安全性高，对小鼠主要脏器无明显影响;HCQ-NDs+US组肺转移程度最轻（P＜0.05),且肿瘤MMP2、MMP9的表达最低。 结论:HCQ-NDs与UTMD联合应用具有较强的协同抗肿瘤作用，且安全性高，另外该策略可明显抑制肿瘤转移，这与MMP2、MMP9的表达下降有关。
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