摘要
研究背景：骨肉瘤（Ostesarcoma,OS）是儿童和青少年中较为常见的原发性肿瘤，目前临床中主要采取手术和化疗的治疗方式，然而化疗药物的毒副作用和肿瘤耐药的发生严重影响OS疗效，在过去20年没有取得很好的治疗进展。光动力治疗（Photodynamictherapy，PDT）作为一种新型抗癌治疗方式受到广泛关注，但是光敏剂对于OS缺乏靶向性严重限制其疗效和临床推广。 研究目的：本研究使用人OSHOS的细胞膜（Cytomembrane）包裹装载光敏剂IR780的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），制备具有同源靶向功能的纳米粒（MH-PLGA-IR780NPs）旨在实现PDT对骨肉瘤的靶向治疗。受益于IR780良好的近红外荧光和光声成像特性，MH-PLGA-IR780NPs在实现靶向OS的同时，可以作为肿瘤探针实现肿瘤诊断和实时监控。更重要的是，同源靶向纳米粒具有更好的组织穿透性，有助于纳米粒在深部肿瘤聚集，为PDT治疗和进一步临床推广奠定基础。同时，本研究探讨MH-PLGA-IR780NPs介导PDT杀伤骨肉瘤的主要死亡方式和相关分子机制。 有鉴于此，本研究主要分为三个部分：第一部分制备具有同源靶向和成像功能的纳米载体（MH-PLGA-IR780NPs），检测其表征和生物安全性；第二部分验证MH-PLGA-IR780NPs的同源靶向能力，体外验证HOS对MH-PLGA-IR780NPs的吞噬能力，体内验证MH-PLGA-IR780NPs在裸鼠荷瘤部位的聚集情况和成像能力；第三部分探讨MH-PLGA-IR780NPs介导PDT对骨肉瘤的杀伤能力和其杀伤骨肉瘤的相关分子机制。 主要研究方法：1）使用双乳法制备PLGA-IR780NPs；2）使用挤推法制备MH-PLGA-IR780NPs；3）使用紫外分光光度计、马尔文粒径仪、投射电镜等检测不同纳米粒的表征；4）体外使用CCK-8检测不同纳米粒的生物安全性；5）裸鼠尾静脉注射不同纳米粒，通过HE染色和血生化分析其生物安全性；6）体外通过共聚焦显微镜和流式定量分析验证MH-PLGA-IR780NPs的同源靶向性、穿透深度；7）体内通过活体荧光成像和光声成像验证MH-PLGA-IR780NPs的同源靶向性；8）体外检测MH-PLGA-IR780NPs-PDT性能：通过DCFH探针和ATP试剂盒检测不同因素处理后ROS和ATP含量；9）验证MH-PLGA-IR780NPs-PDT杀伤骨肉瘤的死亡方式：使用不同死亡方式（凋亡、坏死、自噬、铁死亡）和ROS抑制剂（z-VAD-FMK，Nec-1，Baf-1，Fer-1，NAC）预处理HOS24h，通过CCK-8检测MH-PLGA-IR780NPs-PDT作用后的细胞活性；10）使用流式、Westernblot和JC-1染色等检测MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS的凋亡率和其诱导凋亡的相关分子机制；11）使用流式、Westernblot和流式等检测MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS铁死亡和相关分子机制；12）建立HOS荷老鼠瘤模型，体内验证MH-PLGA-IR780NPs-PDT对移植瘤的抑制作用；13）建立HOS荷老鼠瘤模型，使用铁死亡抑制剂DFO验证MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS凋亡和铁死亡的关系；14）使用铁死亡抑制剂DFO和Fer-1，通过流式、Westernblot和流式等体外验证MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS凋亡和铁死亡的关系。 主要研究结果： 1.使用双乳法和挤推法成功制备纳米粒MH-PLGA-IR780NPs，检测MH-PLGA-IR780NPs表征、生物安全性。 1.1.透射电镜发现纳米粒外有一层脂质膜，考马斯亮蓝提示MH-PLGA-IR780NPs组蛋白显著表达，Westernblot结果显示MH-PLGA-IR780NPs组细胞膜相关蛋白（Na+/K+-ATPase,Ncadherin,Galectin-3,EpCAM,Cxcr4）显著表达，这些结果都提示细胞膜成功包裹纳米粒。 1.2.使用马尔文粒径仪检测MH-PLGA-IR780NPs平均粒径是236.8nm，Zeta电位为-10.09±0.70mV，紫外分光光度计明确MH-PLGA-IR780NPs具有IR780典型的吸收峰。 1.3.不同浓度的MH-PLGA-IR780NPs（PLGA:0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/mL）与HOS共培养不同时间（0,12,24,48h），CCK-8结果提示当MH-PLGA-IR780NPs的浓度高于0.6mg/mL对细胞有低毒性作用，MH-PLGA-IR780NPs的浓度低于0.6mg/mL各组之间无显著差异。 1.4.建立荷老鼠瘤模型，尾静脉注射MH-PLGA-IR780NPs(PLGA：5mg/mL,200μL)1，7，14，28天后，通过血生化分析和心、肝、脾、肺、肾重要脏器的HE染色明确纳米粒对裸鼠没有毒副作用。 2.MH-PLGA-IR780NPs在体外、体内具有同源靶向性，可以作为肿瘤探针。 2.1.体外共聚焦显微镜和流式定量分析明确HOS细胞膜可以增强PLGANPs和PLGA-IR780NPs对HOS的细胞吞噬，体内活体荧光成像和光声成像证明MH-PLGA-IR780NPs可以在HOS裸鼠移植瘤中显著聚集。 2.2.体外共聚焦显微镜和流式定量分析，体内活体荧光成像和光声成像均证明MH-PLGA-IR780NPs仅对HOS具有靶向性，对乳腺癌细胞4T1、肺癌细胞A549、骨肉瘤其他细胞系（MG63、K7M2）靶向性欠佳，且对人成骨细胞HFOB没有靶向性，不会在进行PDT靶向治疗的同时损伤正常骨组织。 2.3.MH-PLGA-IR780NPs在体内具有良好的荧光强度和光声信号，可以作为潜在的肿瘤探针实现骨肉瘤诊疗一体化。 3.同源靶向可以显著提高PDT对骨肉瘤的杀伤效果，MH-PLGA-IR780NPs-PDT杀伤HOS的主要死亡方式是凋亡和铁死亡，诱导凋亡的主要途径是线粒体凋亡途径，诱导铁死亡的主要途径是激活NCOA4介导的铁自噬和抑制XC-使GPX4失活。 3.1.使用DCFH-DA探针染色和ATP试剂盒检测发现MH-PLGA-IR780NPs-PDT可以产生大量ROS并消耗细胞内ATP，导致线粒体损伤。 3.2.通过JC-1染色，共聚焦显微镜、流式定量分析和Westernblot等明确MH-PLGA-IR780NPs-PDT可以诱导HOS线粒体凋亡。 3.3.通过Liperfluo和C11-BODIPY染色，共聚焦显微镜和流式定量分析发现MH-PLGA-IR780NPs-PDT产生大量LPOs和Lipid-ROS。Westernblot和免疫荧光证明MH-PLGA-IR780NPs-PDT一方面可以激活HOS细胞NCOA4表达，进而抑制FTH和FTL，最终使细胞内Fe2+含量升高；另一方面通过抑制SLC7A11和SLC3A2，从而使GPX4失活，使HOS对LPOs和Lipid-ROS的细胞毒性作用更加敏感。 3.4.MH-PLGA-IR780NPs-PDT可以显著抑制HOS裸鼠移植瘤的生长且具有生物安全性。 3.5.使用铁死亡抑制剂DFO可以显著抑制MH-PLGA-IR780NPs-PDT对HOS裸鼠移植瘤的抑制作用；在体外实验中，通过共聚焦显微镜、流式定量分析和Westernblot等证明铁死亡抑制剂DFO和Fer-1可以显著抑制MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS凋亡。 综上所述，本文通过构建具有同源靶向能力的纳米载体平台（MH-PLGA-IR780NPs），并结合IR780优越的成像能力，提高IR780在近红外光源下体内、体外对骨肉瘤的杀伤效果，为骨肉瘤诊疗一体化提供新的思路。同时，分析MH-PLGA-IR780NPs-PDT杀伤骨肉瘤的主要死亡方式和相关分子机制是激活线粒体凋亡途径诱导的细胞凋亡，铁死亡的诱导则是由激活NCOA4介导的铁自噬和GPX4失活协同完成。并继续论证MH-PLGA-IR780NPs-PDT诱导HOS的铁死亡可能作为其诱导凋亡的“分子开关”，为PDT靶向治疗骨肉瘤乃至肿瘤学提供新的数据支撑和研究思路。
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