摘要
肺癌的发病率和死亡率逐步上升，所有肺癌的85％为非小细胞肺癌，近年来，将抗癌药物和基因联合应用引起了广泛的关注。其中文献报道最多的是，将抗癌药物和siRNA共同装载到同一载体中实现联合给药，提高治疗效果。脂质体具有封闭的磷脂双层囊泡结构，被作为共载载体有巨大的优势。表面带正电荷的阳离子脂质可以将带负电的siRNA静电压缩，同时为了更好地实现肿瘤靶向递送，在表面通过静电作用装载与肿瘤细胞γ-谷氨酰转肽酶特异性结合的聚-γ-谷氨酸（γ-PGA），制备共载脂质体用于药物和基因递送。本课题的主要研究内容及结果如下: 1γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物的制备及理化性质表征 首先在课题组前期制备的培美曲塞二钠阳离子脂质体(PMX-CL)基础上，采用匀质技术制备满足后续试验要求的PMX-CL，然后通过静电孵育压缩siRNA得到PMX和siRNA共载阳离子脂质体(PMX/siRNA-CL)，再通过静电作用将γ-PGA修饰到脂质体表面得到γ-PGA修饰的PMX和siRNA共载脂质体（γ-PGA-PMX/siRNA-CL）复合物，最后对该复合物进行初步稳定性和体外释药行为考察。 实验结果表明，在CL/siRNA质量比为234∶1，γ-PGA/siRNA质量比为3∶1时，γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物的粒径为（222.07±1.23）nm，此时可借助实体瘤的滞留效应和高通透性促进肿瘤区域的蓄积，与γ-谷氨酰转肽酶(GTT)特异性结合实现肿瘤靶向;同时γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物在24h内可以保护siRNA免受血清、RNA酶A和支气管肺泡灌洗液(BALF)的降解，增加siRNA的稳定性;该复合物48h体外累积释放PMX百分率为（71.49±0.78）％。 2γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物的体外细胞评价 以人A549肺癌细胞作为研究对象，采用流式细胞仪与倒置荧光显微镜考察Cy3-siRNA的摄取情况;通过MTT法考察空白CL和γ-PGA-CL载体的安全性;采用流式细胞仪考察γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物对A549细胞的细胞周期和凋亡的影响;采用实时定量qPCR和Western-Blot试验考察复合物对A549细胞的Bcl-2基因和蛋白表达水平的影响。 细胞摄取和毒性实验结果表明γ-PGA-CL载体具有更优的摄取效果和更好的安全性;细胞周期和凋亡试验结果显示γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物组细胞的S期有显著增加，抑制DNA的合成，促进细胞凋亡的效果明显优于其他组;实时定量qPCR和Western-Blot实验表明γ-PGA-PMX/siRNA-CL可以将PMX和siRNA共同递送到A549细胞内，共同发挥基因和蛋白沉默作用效果明显。 3γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物的体内药效学研究 以荷LLC的BABL/c小鼠作为肿瘤模型，首先采用肿瘤组织冰冻切片技术和小动物活体成像系统考察Cy5-siRNA在肿瘤区域的分布;然后将荷瘤小鼠分为八组，每组五只，在两周内分别尾静脉注射(1)生理盐水;(2)游离PMX;(3)γ-PGA-CL;(4)游离siRNA;(5)γ-PGA-NCsiRNA-CL;(6)γ-PGA-PMX-CL;(7)γ-PGA-siRNA-CL;(8)γ-PGA-PMX/siRNA-CL五次，在特定时间点称量小鼠体重和测量肿瘤体积，结束后剖出肿瘤称重，考察抑瘤效果;最后以小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官指数和HE染色，考察各组织器官的安全性。 实验结果表明，γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物能够将siRNA递送到肿瘤区域发挥治疗作用，同时增加其稳定性;与γ-PGA-PMX-CL组和γ-PGA-siRNA-CL组比较，γ-PGA-PMX/siRNA-C复合物组的小鼠肿瘤体积和重量显著降低，证明药物和基因联合应用明显增强肿瘤的抑制作用，治疗效果显著;给药后各组小鼠体重无下降，肺、心、肝、脾、肾等器官指数和HE染色结果与对照组无明显差异，表明该复合物和载体具有良好的安全性。 综上，本课题成功制备了肿瘤靶向的γ-PGA-PMX/siRNA-CL复合物，较单独给药组具有更强的肿瘤抑制作用，且载体对体内器官没有明显的毒性，为NSCLC的临床治疗提供了一种新思路，具有较大的经济开发价值和临床应用前景。
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