摘要
目的： 雷公藤甲素（Triptolide，TP）是雷公藤（TripterygiumwilfordiiHood.F,TWHF）主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、免疫调节和抗肿瘤等药理活性。同时，TP对肝脏、心脏和肾脏等也具有毒性。研究表明，TP毒性作用的产生与诱导膜损伤、细胞线粒体损坏、内质网应激等密切相关，导致细胞代谢功能障碍和氧化应激，最终发生凋亡。有文献报道，TP可以诱导肾小管上皮HK-2细胞凋亡，但其毒性机制尚未完全清楚。自噬广泛存在于真核细胞中，对细胞内稳态的维持有至关重要的作用，自噬调控失衡与多种疾病发生密切相关。因此，本文通过TP诱导HK-2细胞损伤模型，探究TP对HK-2细胞凋亡和自噬的作用及其关系，为TP肾毒性的防治提供新思路和理论依据。 方法： 1、以HK-2细胞为研究对象，分别采用CCK-8法、AO/EB染色、AnnexinV-FITC/PI双染法测定TP对HK-2细胞存活率、细胞形态及细胞凋亡率的影响。同时，通过JC-1荧光探针检测TP对HK-2细胞线粒体膜电位的影响，Westernblot检测TP处理HK-2细胞后凋亡蛋白cleavedcaspase9、Bax和Bcl-2的表达水平。 2、免疫荧光染色观察HK-2细胞自噬活性，Westernblot检测TP处理HK-2细胞后自噬标志蛋白LC3Ⅱ、Beclin1和p62（SQSTM1）的表达水平。 3、采用Westernblot和CCK-8法检测自噬激动剂雷帕霉素Rap和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤3-MA分别与TP共同作用对HK-2细胞LC3Ⅱ、p62（SQSTM1）蛋白表达和细胞存活率的影响。AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染法检测Rap和3-MA分别与TP共同作用对HK-2细胞形态和凋亡率的影响。Westernblot测定Rap和3-MA分别与TP共同作用对HK-2细胞内cleavedcaspase9/caspase9蛋白表达比值的影响。 结果： 1、TP可显著抑制HK-2细胞活力，且呈浓度和时间依赖性；AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示，不同浓度TP处理HK-2细胞24h后，随着药物浓度的升高，HK-2细胞凋亡逐渐升高；此外，JC-1荧光探针检测结果显示，经TP处理后，HK-2细胞线粒体膜电位下降；Westernblot结果显示，TP处理HK-2细胞后，cleavedcaspase9/caspase9和Bax/Bcl-2蛋白比值升高。 2、免疫荧光染色结果显示，TP处理HK-2细胞后LC3Ⅱ荧光强度增强，点状聚集增多；Westernblot结果表明，TP可使细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值升高、Beclin1表达上升和p62（SQSTM1）表达下降。 3、Westernblot检测结果显示，与TP组相比，Rap和TP共同处理HK-2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值进一步升高，p62（SQSTM1）表达进一步下降。与TP组相比，3-MA和TP共同处理HK-2细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值下降，p62（SQSTM1）表达上升。CCK-8检测结果显示，Rap和TP共同处理组较TP组细胞存活率低，3-MA和TP共同处理组较TP组细胞存活率高。AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示，Rap增加TP诱导的HK-2细胞凋亡，而3-MA则减少TP诱导的HK-2细胞凋亡；此外，Westernblot结果显示，Rap与TP共同处理HK-2细胞凋亡蛋白cleavedcaspase9/caspase9比值较TP组升高，反之，3-MA与TP共同作用HK-2细胞，凋亡蛋白cleavedcaspase9/caspase9比值较TP组下降。 结论： CCK-8测定结果显示，TP对HK-2细胞具有毒性，且呈剂量和时间依赖性；AO/EB染色和AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示，TP能够诱导HK-2细胞凋亡；JC-1荧光探针检测结果显示，TP能够降低HK-2细胞线粒体膜电位；Westernblot检测结果显示，TP能够升高细胞内cleavedcaspase9/caspase9和Bax/Bcl-2蛋白比值，表明TP能够通过线粒体途径介导HK-2细胞发生凋亡。并且，本文采用免疫荧光染色和Westernblot检测发现，TP能够诱导HK-2细胞发生自噬。通过自噬激动剂Rap增强TP诱导HK-2细胞自噬，TP对HK-2细胞毒性增强，细胞凋亡水平上升；自噬抑制剂3-MA抑制TP诱导HK-2细胞自噬，TP对HK-2细胞毒性减弱，细胞凋亡水平下降，提示我们可以通过抑制自噬减轻TP导致的肾毒性。
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