摘要
目的： 以体外培养的BTBR小鼠皮质神元为研究对象，通过培养基中添加微管稳定剂埃博霉素D，考察其对BTBR小鼠皮质神元兴奋性突触结构的影响，进一步探讨微管稳定性参与孤独症谱系障碍发病的作用机制，以期为体内实验研究埃博霉素D对孤独症谱系障碍兴奋性突触结构及行为改善提供实验基础及理论依据。 方法： 1.利用体外培养的方法获得BTBR小鼠原代皮质神经元，并采用MAP2-神经元特异性标记抗体，对所培养的神经元进行免疫荧光法纯度鉴定。 2.培养至相对成熟的BTBR小鼠皮质神经元，随机分为埃博霉素D实验组和溶剂对照组。实验组给予10nM埃博霉素D、溶剂对照组给予相同体积的0.1%DMSO溶剂，于培养箱中继续培养24h。24h后弃去培养基，预热的正常培养基分别清洗对照组、实验组细胞各2次，对照组、实验组细胞一组于培养箱中继续培养90min，另随机选取一组实验组、对照组给予4℃冷刺激90min。后取出4组细胞，分别给予神经元细胞骨架标志蛋白α-Tubulin免疫荧光标记微管，形态学考察神经元在冷处理干预下的稳定性，并比较微管稳定剂埃博霉素D干预后微管在形态结构方面的稳定性变化。 3.条件培养基干预24h结束后，收集细胞提取总蛋白，免疫印迹技术检测微管稳定的标志蛋白（Acetyl-Tubulin、α-Tubulin）、微管相关蛋白（MAP2、STOP）的表达及兴奋性突触结构前后膜标志蛋白（VGLUT1、PSD95）、谷氨酸受体相关蛋白（GluN2B、mGluR5）的表达水平。 4.Dil染液标记树突棘，考察埃博霉素D对树突棘密度的影响。 5.统计学方法：蛋白表达的比较、树突棘密度结果的差异性比较采用t检验，对所有结果有统计学意义的P值分别为*Plt;0.05，**Plt;0.01（以α=0.05为检验水准）。 结果： 1.与溶剂对照组相比，10nM的埃博霉素D干预后可以增加BTBR小鼠皮质神经元微管的冷稳定性及微管稳定的标志蛋白、微管相关蛋白的表达。 2.与溶剂对照组相比，10nM埃博霉素D干预后可以增加BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构相关蛋白及谷氨酸受体相关蛋白的表达。 3.与溶剂对照组相比，10nM埃博霉素D干预后可以增加BTBR小鼠皮质神经元的树突棘密度。 结论： 1.微管稳定剂埃博霉素D能改善体外培养的BTBR小鼠皮质神经元兴奋性突触结构，其机制可能与增加微管稳定性有关。 2.这些结果进一步验证了微管稳定性在孤独症谱系障碍发病中的重要作用，为进一步体内实验研究埃博霉素D对孤独症谱系障碍兴奋性突触结构及行为改善提供实验基础和理论依据。
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